Abstract
Ætiologien af neurodegenerative sygdomme synes at involvere modtagelige gener og miljøfaktorer. Giftige metaller anses for at være vigtige miljøforurenende stoffer. Efter vores undersøgelse af et tilfælde af forbedring af multipel sklerose (MS) som følge af fjernelse af aluminium (Al) og andre giftige metaller, har vi undersøgt den mulige sammenhæng mellem Al-forgiftning og ND. Vi anvendte den langsomme intravenøse behandling med det chelaterende middel EDTA (calciumdinnatriumethylendiamin-tetraeddikesyre) (chelationstest) til at fjerne Al og påviste det i urinen indsamlet fra patienterne i 12 timer. Patienter, der var ramt af MS, udgjorde 85,6 % af den samlede ND. Al var til stede i 44,8 % af de tilfælde, der omfattede ND og raske patienter. Al-niveauet var betydeligt højere hos ND-patienter end hos raske personer. Vi viser her, at behandling af patienter ramt af Al-belastning med ti EDTA-chelatbehandlinger (EDTA intravenøs administration en gang om ugen) var i stand til at reducere Al-forgiftning betydeligt.
1. Introduktion
Bekæmpelse af menneskers eksponering for giftige metaller kan resultere i skader på en række organsystemer.
Et af de mest almindeligt undersøgte giftige metaller, aluminium (Al), er impliceret i mange sygdomme. Al er et meget rigeligt og allestedsnærværende som miljø- og industritoksisk stof og er også indeholdt i mange fødevarer og er involveret i skelet-, hæmatologiske og neurologiske sygdomme . Al-toksicitet er forårsaget af forstyrrelser i homeostasen af metaller som magnesium, calcium og jern (Fe): Al efterligner faktisk disse metaller i deres biologiske funktioner og udløser mange biokemiske forandringer . Især udøver Al både direkte genotoksicitet i primære humane neurale celler og inducerer neurodegeneration gennem en stigning i Fe-akkumulering og produktion af oxygenreaktive arter (ROS) . Al-inducerede oxidative skader på DNA er tidligere blevet forbundet med neurodegeneration i forskellige regioner i rottehjernen . Desuden er det for nylig blevet påvist, at Al3+ fremkalder transportørmedieret dopaminneurondegeneration i nematoden Caenorhabditis elegans .
Fjernelse af giftige metaller fra menneskekroppen kan være et nyttigt redskab til at undgå begyndelsen eller udviklingen af mange sygdomme i forbindelse med metalforgiftning.
De metoder, der er nyttige til bestemmelse af visse metalindhold i biologiske prøver til overvågningsformål, blev udviklet for nogle år siden. Faktisk er både giftige og essentielle metaller blevet analyseret i blod, urin og hår ved hjælp af atomabsorptionsspektroskopi . Efterfølgende er der blevet udviklet metoder til analyse af sporstoffer i biologiske materialer fra mennesker, og induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS) blev anset for at være at foretrække til screening af flere grundstoffer . Det synes imidlertid vanskeligt at påvise metaloverskud i blod og urin under andre forhold end akut metalforgiftning. Faktisk afspejler forhøjelsen af giftige metaller i blodet kun den seneste eksponering for metaller . Efter akut eksponering bevæger toksiske metaller sig hurtigt fra blodet til mange væv, hvor de bliver lagret, f.eks. i centralnervesystemet (CNS). Den eneste måde, hvorpå man kan fjerne akkumulerede giftige metaller fra menneskelige organer, er at binde disse metaller ved hjælp af chelaterende stoffer med det formål at danne komplekser, der kan udskilles i urinen. Niveauerne af toksiske metaller kan undersøges i urinprøver fra patienter efter “udfordring” med et chelaterende middel (“chelationstest”). Blandt kendte chelateringsmidler har vi valgt calciumdinnatriumethylendiamintetraeddikesyre (CaNa2EDTA eller EDTA), som blev indgivet intravenøst. Stabilitetskonstanterne for aluminium og andre metaller af biokemisk interesse med forskellige chelatdannere, herunder EDTA, er tidligere blevet undersøgt . Udviklingen af et sæt metalkomplekskonstanter tjente til at korrelere metallernes kemiske og funktionelle egenskaber og antydede, at EDTA var i stand til at mobilisere aluminium.
Tidligere er toksiske niveauer af Al blevet forbundet med neurodegenerative sygdomme (ND). En mulig forbindelse mellem Al og Alzheimers sygdom er blevet fremhævet . I 1991 blev det rapporteret, at behandling med lav dosis intramuskulær desferrioxamin (DFO), en trivalent chelator, der kan fjerne overskydende jern og/eller aluminium fra kroppen, bremsede udviklingen af Alzheimers sygdom.
I det foreliggende arbejde har vi besluttet at undersøge, om Al var involveret i neurotoksicitet. Vi evaluerede således Al-belastningen i kroppen hos patienter, der var ramt eller ikke ramt af ND. Vi undersøgte også den mulige reduktion af denne byrde efter behandlinger med det chelaterende middel EDTA.
2. Materialer og metoder
2.1. Undersøgelsesdesign og rekruttering af patienter
Ud af 471 på hinanden følgende forsøgspersoner, der havde gennemgået en lægeundersøgelse i et ambulant lægecenter, blev kun 211 udvalgt og indskrevet til denne undersøgelse på grund af beviser for deres Al-belastning og overholdelse af protokollen, f.eks. ved at modtage chelateringsbehandling en gang om ugen efter personligt valg. De ND, der blev undersøgt i denne undersøgelse, var multipel sklerose (MS), amyotrofisk lateralsklerose (ALS), Parkinsons sygdom (PD) og Alzheimers sygdom (AD). Mange MS-patienter var tidligere blevet behandlet med konventionelle lægemidler, der anvendes ved sådanne patologier (f.eks. immunsupprimerende midler som mitoxantron og azathioprin, immunmodulerende midler med et bredt spektrum af immunmodulerende midler som glatirameracetat og interferon og monoklonale antistoffer som rituximab og natalizumab). Nogle MS-patienter var aldrig tidligere blevet behandlet med lægemidler. Der er også blevet rekrutteret patienter, der ikke er ramt af kendte sygdomme (raske forsøgspersoner eller kontroller), samt patienter, der er ramt af ikke-neurodegenerative patologier (ikke ND, hvilket henviser til sygdomme, der ikke klassificeres som ND, som f.eks. fibromyalgi). Nogle raske patienter, som tidligere havde været udsat for miljø- eller arbejdstoksiske metaller, foretrak at undersøge deres eventuelle forgiftning ved at evaluere tilstedeværelsen af sådanne metaller i hårprøver. De blev derfor udelukket fra den foreliggende undersøgelse. Alle patienter gav informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse. De var mellem 18 og 75 år gamle.
2.2. Chelationstest og vurdering af Al i urinen
Patienterne er blevet underkastet chelationstest for at påvise en eventuel Al-forgiftning. De blev nemlig opfordret til at indsamle urinprøver før og efter den intravenøse behandling med det chelaterende middel EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre, f.eks. calciumdinatriumedetat, 2 g/10 mL fortyndet i 500 mL fysiologisk saltvand, Farmax srl, Brescia, Italien). EDTA blev langsomt administreret intravenøst til patienterne (infusionen varede ca. 2 timer). Urinindsamlingen efter chelatdannelsen varede 12 timer. Prøverne fra denne indsamling blev omhyggeligt pakket ind i sterile hætteglas og transporteret til det toksikologiske laboratorium (Doctor’s Data Inc., St. Charles, IL, USA), hvor de blev behandlet. Prøverne blev syreopløst med certificerede metalfrie syrer; opløsningen fandt sted i et lukket mikrobølgeopløsningssystem med lukket beholder. Til prøvefortynding blev der anvendt ultrarent vand.
For at undgå kontaminering blev der kun anvendt plastmaterialer. Alt laboratorieudstyr (pipettespidser, målekolber osv.) blev nedsænket i mindst 48 timer i en 10 % (v/v) HNO3/ethanolopløsning og blev kort før brug vasket med Milli-Q renset vand. For at undgå kontaminering fra luften blev alle trin i forberedelsen af prøver og reagenser udført på en ren bænk i klasse 100.
Testen blev udført ved hjælp af induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS) ved hjælp af kollisions/reaktionscellemetoder kombineret med ionmolekyl-kemi, en ny pålidelig metode til reduktion af interferens. Metoden er for nylig blevet anvendt til biomonitorering af 20 sporstoffer i blod og urin fra erhvervsmæssigt eksponerede arbejdstagere . Der blev anvendt certificerede urinstandarder og interne standarder til kvalitetskontrol og til validering af resultaterne. For at undgå den potentielt store fejlmargin, der kan skyldes væskeindtagelse og prøvevolumen, blev resultaterne rapporteret i mikrogram (μg) pr. g kreatinin. Kreatinin blev målt ved omvendt højtydende væskekromatografi og blev anvendt til at korrigere det samlede volumen af urin-Al for forskelle i den glomerulære filtrationshastighed hos de enkelte personer på tidspunktet for stikprøven . Forskningsprogrammet med titlen “Effekter af kelationsterapi med EDTA hos patienter, der er påvirket af patologier relateret til eksponering (akut eller kronisk) for giftige metaller” er blevet godkendt af det etiske engagement ved universitetet i Milano (Italien) (nummer 64/2014).
2.3. Klinisk evaluering af patientens symptomforbedring ved MS
I mangel af en diagnostisk test, der er specifik for MS, har det neurologiske samfund vedtaget diagnostiske kriterier, som blev erstattet i tiden . Magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), analyse af cerebrospinalvæske og visuelt fremkaldt potentiale, der er blevet tilføjet til den kliniske diagnose, er blevet anset for at have begrænsninger med hensyn til sensitivitet og specificitet. Efterfølgende har MRI fået større betydning. Diagnosen af forbedring af patientens symptomer er dog i øjeblikket baseret på kliniske kriterier som reduktion af neurologisk handicap (paræstesi, gang ataksi, spasticitet, optikusneuritis og blærenedsættelse) og træthed. Undertiden er symptomer på ALS, som parese, muskelatrofi og dysartri, forbundet med MRI- og cerebrospinalvæskeanomalier, der er typiske for MS. Faktisk har vi betragtet forbedring af patientens symptomer som helbredelse af klinisk handicap, f.eks. arbejdsevne, reduktion af spasticitet, forsinkelse af tilbagefald og/eller forsvinden af træthed.
2.4. Effekt af EDTA-kelationsterapi på Al-forgiftning
Patienter, der afslørede Al-forgiftning (ved undersøgelse af dets niveauer i urinprøver), blev underkastet EDTA-kelationsterapi. EDTA (2 g i 500 mL fysiologisk saltvand) blev intravenøst infunderet til hver patient i ca. 2 timer. Behandlingen blev givet en gang om ugen og varede ti uger. Ved afslutningen af behandlingerne blev urinens Al-niveauer analyseret som tidligere beskrevet.
2,5. Dataanalyse
Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Microsoft Excel 2010 og IBM SPSS Statistics 20 (IBM Armonk, New York, USA). Der blev anvendt en logistisk regressionsanalyse til at undersøge de relative bidrag fra flere variabler til operationsresultaterne. blev betragtet som signifikant.
3. Resultater
3.1. Patienternes karakteristika
Figur 1 rapporterer fordelingen af patienter, der viste Al-forgiftning.
Skema over de indskrevne forsøgspersoners karakteristika.
De mest repræsenterede patienter, der blev påvirket af ND, var patienter med MS (85,6 % af den samlede ND). Faktisk sammenlignede vi både gruppen af MS-patienter og gruppen af ND-patienter med gruppen af raske patienter.
3.2. Al-forgiftning
Alle patienter viste ikke Al-forgiftning før EDTA-udfordringen (data ikke vist). Alle patienter, der var påvirket af ND, viste forgiftning med forskellige giftige metaller (data ikke vist). Efter udfordring med EDTA var Al til stede i 44,8 % af tilfældene omfattende ND og raske patienter. Niveauerne af Al-forgiftning, som fremkom ved evaluering af μg/g kreatininindhold af Al i urinprøverne indsamlet efter den første intravenøse behandling med EDTA (chelationstest), er vist i figur 2. Dataene viser, at Al-værdierne var signifikant højere i urinprøverne fra SM- og ND-patienter end hos de raske patienter.
Aluminium (Al)-niveauer vurderet i urinprøverne fra undersøgte personer efter chelationstest (mørk) og efter ti chelationsbehandlinger med EDTA (lys), udtrykt som middelværdi ± SEM af μg/g kreatinin. De undersøgte personer var raske patienter, patienter ramt af multipel sklerose (MS) og patienter ramt af alle neurodegenerative sygdomme (ND). Al-niveauerne hos både MS- og ND-patienter var signifikant højere end hos raske personer efter chelationstest ( versus raske). Efter chelationsterapier med EDTA var Al-niveauerne signifikant lavere end de niveauer, der blev opnået efter chelationstest ( # versus og ## versus ).
3.3. Nytten af EDTA-kelationsterapi
Effekten af EDTA-kelationsterapi er også rapporteret i figur 2. De patienter, der har vist Al-forgiftning efter chelationstest, blev nemlig underkastet chelationsterapi (intravenøs indgift af EDTA en gang om ugen). Efter ti behandlinger blev Al-niveauet i urinprøverne yderligere evalueret og sammenlignet med det niveau, der blev opnået efter chelationstesten. Det blev påvist, at EDTA-administration var betydeligt effektiv med hensyn til at fjerne Al-belastningen, som vist i figur 2. Vores resultater viste, at reduktionen af tiden for Al-forgiftning hænger godt sammen med forbedrede kliniske forhold hos patienterne. Faktisk præsenterede de, i forskelligt omfang, reduktion af neurologisk handicap og træthed.
Noteringsværdigt nok var effektiviteten af EDTA-chelateringsbehandling mere tydelig hos ND end hos raske patienter.
4. Diskussion
Toksiske metaller, pesticider og phenoler betragtes som store miljøforurenende stoffer . Giftige metaller klassificeres som ikke-biologisk nedbrydelige stoffer, ligesom plast og rengøringsmidler, fordi de ikke nedbrydes af mikroorganismer. De udgør en global sundhedsrisiko på grund af deres evne til at bidrage til en række sygdomme. I denne forbindelse er Al (som er et meget reaktivt grundstof og et allestedsnærværende miljøforurenende stof) blevet sat i forbindelse med visse sygdomme . Faktisk er osteomalaci en skeletsygdom, der er relateret til Al-toksiske virkninger som f.eks. fosfatmangel, svækket Ca-optagelse og dysfunktionel osteoblastproliferation . Desuden kan Al-eksponering forringe Fe-absorptionen i tarmene, hvilket fremmer en anæmisk tilstand . Desuden kan Al spille en aktiv rolle i de patogenetiske mekanismer for neurologiske sygdomme. Det er især blevet påvist, at Al er ansvarlig for kritiske neuropatologiske læsioner i Alzheimers sygdom og andre beslægtede lidelser på grund af dets evne til at krydsbinde hyperfosforylerede proteiner . Al er blevet påvist i amyloidfibre i kernerne af senile plaques i hjerner fra AD-patienter . Tilstedeværelsen af Al i biologiske systemer kan føre til en vigtig prooxidant aktivitet ved at fremme superoxiddannelse gennem Fenton-reaktionen . For nylig er det endvidere blevet foreslået, at Al fjernes hos AD-patienter ved behandling med DFO . Der er gennemført en vellykket behandling med DFO (både i lav og i standarddosis) for Al-overbelastning hos hæmodialysepatienter . Desuden er DFO blevet vist at kunne udøve beskyttende virkninger i hjernevævet hos mus mod Al-inducerede strukturelle og metaboliske ændringer . Da nogle patienter imidlertid kan have intolerance over for DFO eller udvikle DFO-bivirkninger som f.eks. allergiske reaktioner, neurologiske symptomer eller tydelige gastrointestinale forstyrrelser, besluttede vi at anvende EDTA som et chelatdannende middel. Chelatoren N-(2-hydroxyethyl) ethylendiamintrieddikesyre (HEDTA), der ligner EDTA, har vist sig at være effektiv, også i forbindelse med selen, mod Al-induceret oxidativ stress i rottehjerne .
Højere urinudskillelse af Al og Fe er tidligere blevet påvist hos MS-patienter .
Vi har tidligere undersøgt tilfældet med en ung mand ramt af MS, som i nogle år er blevet behandlet uden held med de nuværende behandlinger . Symptomer, som patienten afslørede, var subakut synstab, diplopi og smerter ved øjenbevægelser som de første symptomer på optikusneuritis; forstyrrelse af finmotorikken; paræstesi og gang ataksi; blære dysfunktion; og betydelig træthed. Vi undersøgte hans niveauer af toksiske metaller i urinen efter intravenøs “udfordring” med EDTA. Patienten viste forhøjede niveauer af Al, Pb og Hg i urinen. Han blev faktisk udsat for behandling med EDTA to gange om måneden. Under behandlingen viste patienten med tiden forbedrede symptomer, der tydede på en MS-remission. Han genvandt faktisk synet og blærefunktionen, og paræstesien forsvandt ligesom trætheden. Da det mest repræsenterede giftige metal hos denne patient var Al, besluttede vi at undersøge den mulige sammenhæng mellem Al-forgiftning og ND.
Vores resultater viser, at Al-niveauerne målt i urinprøver fra patienter, der var ramt af både MS særskilt undersøgt og samlet ND undersøgt, var signifikant højere end hos raske patienter, som det fremgår af figur 2. Sunde patienter viste omkring 80 μg/g kreatinin, som gennemsnitlige Al-niveauer, selv om de normale værdier er 35 μg/g kreatinin. Disse data tyder på, at Al-forgiftning ikke nødvendigvis er relateret til udbruddet af kliniske symptomer på ND. Desuden er kontrolpatienter muligvis i stand til at begrænse yderligere Al-belastning gennem neuroprotektive eller antioxidantmekanismer, som er fraværende hos ND-patienter. Kliniske vurderinger af hver enkelt patient tyder på, at der er en vigtig sammenhæng mellem Al-forgiftning og forringelse af bevægelser, paræstesi, ataksi og andre symptomer hos personer med ND. De patienter, der havde de højeste værdier af Al i urinprøven, havde også de mest alvorlige sygdomstegn på klinisk plan. Indvendingen om, at det kan være farligt at mobilisere (ved hjælp af chelaterende stoffer) Al fra relativt sikre steder som f.eks. knogler og deponere dette stærkt neurotoksiske metal i CNS, modsvares af den betragtning, at patienter, der er ramt af ND, var ramt af Al-belastning (som er ansvarlig for sygdommens patogenese) i CNS før chelateringen. Desuden fjernes de komplekser, der dannes af det giftige metal med chelateringsmidler, godt af nyrerne. Nylige undersøgelser viste, at alvorlige adfærdsmæssige motoriske underskud og tab af motoriske neuroner i nervesystemet var resultatet, når en Al-vaccineadjuvans blev anvendt på en dyremodel. Mus, der blev injiceret med Al-hydroxid, viste nemlig en betydelig stigning i celledøden i rygmarven og den motoriske cortex, hvilket primært påvirkede de motoriske neuroner og fremkaldte neuroinflammation. Virkningerne lignede meget de skader, der ses i menneskelig ALS .
Som det for nylig er blevet rapporteret, synes immunsystemet også at være følsomt over for Al-eksponering . Virkninger af Al på autoimmunitet, oral tolerance, CD4+ og CD8+ ekspression, overfølsomhed og erytrocyt immunfunktion tyder på immunotoksikologisk aktivitet. Det er blevet foreslået, at mange af de træk ved Al-induceret neurotoksicitet delvis kan skyldes autoimmune reaktioner.
Endelig betragtes Al i en nyere rapport af Exley C som en potentiel medvirkende årsag til udbrud, progression og aggressivitet af ND, selv om det synes at være vanskeligt at fastslå, hvornår det bidrager til sygdomsætiologien. Da Al imidlertid udgør en risiko for menneskers sundhed, er det nødvendigt at gennemføre foranstaltninger til at reducere dets belastning af kroppen til den laveste praktiske grænse.
Hvilken strategi for fælles behandling af skader fremkaldt af giftige metaller kan foreslås? Intracellulær optagelse af giftige metaller vil blive tilstrækkeligt forhindret af relevante inhibitorer (chelatorer), mens ROS-generering og ROS-medierede processer vil blive forhindret eller forbedret af relevante antioxidanter og fanger af frie radikaler og Fe.
I vores erfaring har fjernelse af giftige metaller, som vist i tidligere undersøgelser og i nærværende undersøgelse, haft gavnlige virkninger ved at forbedre patienternes symptomer . Der blev ikke observeret nogen negative virkninger af EDTA-behandlinger. Metalfjernelse syntes gradvis i tiden og foreslog mange chelationsterapier . Konklusionen er, at vi i den foreliggende undersøgelse viser, at EDTA-chelateringsbehandling kunne reducere Al-byrden hos patienter, der er ramt af ND, ved at forbedre deres kliniske tilstand. Vi håber, at en sådan behandling i fremtiden vil blive betragtet som et nyttigt redskab til at forbedre ND-patienters symptomer.
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.