4.3 Fra linsesvesikel til den modne linse
Linsesvesiklen dannes ved at lukke linseskålen (også kendt som linsegruben) og løsne sig fra den overfladiske ektoderm. Et mellemliggende trin er udviklingen af en linsestængel, der holder den lukkede vesikel og overfladeektodermen sammen i nogle få timer (hos musen). Linseblæren er næsten kugleformet med et stort centralt hulrum; cellerne fra dens bageste pol strækker sig, indtil de når frem til de forreste epitelceller og fylder hele linseblæren; disse langstrakte celler kaldes primære linsefiberceller. Dette trin sker omkring dag 44 i svangerskabet hos menneskelige embryoner og ved E11,5 hos mus (Fig. 10.5). Cellerne ved den forreste pol af linsevesiklen forbliver som epitelceller. Mitotisk aktive celler omkring den centrale region af linseepitelet bevæger sig ind i den ækvatoriale region (eller linsebueregionen), hvor de strækker sig og differentierer sig til sekundære linsefibre. Midtlinjen, hvor sekundære linsefibre fra modsatte punkter af ækvator mødes, kaldes den forreste og bageste linse sutur. De sekundære linsefibre danner koncentriske lag omkring de primære fibre i linsens kerne (hos musen på dag E15,5; fig. 10.5). Med dette arrangement er linsefibrene mod periferien successivt yngre i udviklings- og differentieringsmæssig henseende. Så længe linsen vokser, flytter nye sekundære fibre ind fra ækvator på linsens ydre cortex.
Figur 10.5. Dannelse af linsen. Når linseblæren er dannet, strækker de primære linsefibre sig ud fra linseblærens bageste epithel og fylder hele dens lumen. De sekundære fiberceller begynder at strække sig ved linsebueområdet; fibrene fra modsatte sider mødes ved den forreste og bageste pol og giver anledning til linsesuturerne (som er Y-formede i det tredimensionelle billede). Det sidste trin i linsedifferentieringen er nedbrydningen af cellekerner og mitokondrier, som finder sted omkring fødselstidspunktet hos musen (modificeret i henhold til Graw, 2003; med tilladelse fra Nature Publishing Group).
Både de primære og sekundære fiberceller mister deres mitokondrier og cellekerner under den endelige differentieringsproces: For de primære fibre finder den sted hos mus ved E17/E18 og er afsluttet 2 uger efter fødslen, når musene åbner deres øjenlåg (Vrensen et al, 1991). De sekundære fiberceller, som omslutter de primære fiberceller, mister deres organeller, når de bevæger sig fra den ydre til den indre cortex (Kuwabara og Imaizumi, 1974).
De forreste epitelceller forbliver imidlertid mitotisk aktive som en stamcelle-niche, der producerer sekundære fiberceller. Disse sekundære linsefiberceller er terminalt differentierede celler og mister også deres organeller, når de presses dybere ind i linsen af de efterfølgende fiberceller.
I zebrafisken forekommer der imidlertid flere forskelle i linsens udvikling og differentiering. Især sker den primære fibercelleforlængelse på en cirkulær måde, hvilket resulterer i en embryonal linsekerne med koncentriske skaller af fibre. Den meget tætte afstand mellem kerner af de differentierende sekundære fibre i en smal zone tæt på det ækvatoriale epithel tyder imidlertid på, at sekundære fibercelledifferentiering afviger fra den, der er beskrevet for pattedyr- eller fuglelinser. På grund af disse forskelle bør man være forsigtig, når man ekstrapolerer resultater om zebrafisk til udvikling eller funktion af linsen hos mus eller mennesker (Dahm et al., 2007).
I mus karakteriserer mindst to gener, Pitx3 og Foxe3, betydningen af den forbigående karakter af linsestammestadiet. I museembryoner udtrykkes Pitx3 i linsen under udvikling fra E11, først i linseblæren og senere i det forreste epithel og linseækvatoret. Mutationer i de regulerende eller kodende regioner af Pitx3-genet har vist sig at forårsage fænotypen aphakia (ak) eller øjenløse (eyl) musemutanter, som mangler linser og pupiller (Rieger et al., 2001; Rosemann et al., 2010; Semina et al., 2000). Hos disse mus forbliver linsestilken i flere dage, hvilket i sidste ende fører til en nedbrydning af den rudimentære linseblære, og nethindevæv fylder hele øjenskjoldet. Da Pitx3 også udtrykkes i dopaminerge neuroner i substantia nigra, er disse mus også fremragende modeller for Parkinsons sygdom (Rosemann et al., 2010). I modsætning til musen forårsager mutationer i det humane PITX3 forreste segment mesenkymal dysgenese (ASMD; Semina et al., 1998).
Ak/ak-musene har en okulær fænotype, der minder meget om dyl-musene (dysgen linse), hvilket indikerer, at begge gener er involveret i den samme biologiske proces. Blixt et al. (2000) viste, at dyl-fænotypen er formidlet af en mutation i Foxe3-genet. Hos musen udtrykkes FoxE3 i øjet under udvikling omkring E9,5, i starten af linsesplacodeinduktionen (Fig. 10.2). Efterhånden som linseplakoden dannes, øges ekspressionen af FoxE3 og bliver begrænset til linseblæren, efterhånden som den løsner sig fra den overfladiske ektoderm. To mutationer inden for det DNA-bindende domæne af FoxE3 blev identificeret i dyl-mus. Hos mennesker er mutationer i FOXE3 ansvarlige for anterior segment optical dysgenesis (ASOD). På grund af ekspressionsmønstret for FOXE3 og den variable fænotype hos de heterozygote dyl-mus blev en lille kohorte af patienter med Peters-anomali, hos hvem der ikke kunne påvises PAX6-mutationer, screenet for FOXE3-mutationer. En af patienterne viste sig at være heterozygot for en Arg90Leu-substitution, der påvirker det DNA-bindende domæne af FOXE3 (Ormestad et al., 2002).
Det andet vigtige trin er forlængelsen af cellerne i den bageste halvdel af linsevesiklen, der fylder den med primære fiberceller. I musemutanten “opaque flecks in the lens” påvirker en punktmutation den grundlæggende region af Maf (kodet af et onkogen, der er ansvarlig for muskulo-aponeurotisk fibrosarkom) og forhindrer korrekt dannelse af de primære linsefibre, hvilket fører til en fænotype, der ligner den pulverulente katarakt i en menneskelig familie (Lyon et al., 2003). Mammalian MAF udtrykkes i linseplacode og linseblære og senere i de primære linsefibre.
Sådan har Puk et al. (2008) for nylig karakteriseret en ny ethylnitroso-urea (ENU)-induceret musemutant med en lille øjenfænotype og en tom linseblære i homozygot tilstand. I dette tilfælde blev der identificeret en mutation i genet Gjf1 (også kaldet Gje1). Hos musen koder genet Gjf1 for et connexinlignende protein på 23,8 kDa, som udtrykkes i den bageste del af linseblæren, hvor den primære fiberforlængelse starter. I mutanterne er udtryksmønstret for Pax6, Prox1, Six3 og Crygd ændret, men ikke mønstret for Pax2. Genet Gjf1 menes at være afgørende for dannelsen af de primære linsefibre (Puk et al., 2008) og kan betragtes som et downstream-mål for transkriptionsfaktoren c-Maf; mutationer i det tilsvarende Maf-gen fører til en lignende fænotype i musen (Lyon et al., 2003; Perveen et al., 2007). På nuværende tidspunkt er det ikke klart, om der findes en funktionel menneskelig modstykke til musens Gjf1-gen.
En tredje fænotype uden forlængelse af de primære linsefibre er forårsaget af knockout af Pparbp-genet (der koder for peroxisome proliferator activator receptor binding protein; Crawford et al., 2002). Forholdet mellem disse tre funktionelt forskellige proteiner for dannelsen af de primære linsefiberceller er endnu ikke klarlagt.
Ud over disse tre gener kan Wnt-signalering også spille en rolle i forlængelsen af de primære fiberceller. Faber et al. rapporterede i 2002 en dominant-negativ form af Bmp-receptor 1b (gensymbol: Bmpr1b) i transgene mus. Disse transgene musemutanter viser en hæmning af udviklingen af de primære fiberceller, dog på en asymmetrisk måde: den viste sig kun på den nasale side af linsen i den ventrale halvdel. Forfatterne konkluderede, at forskellige differentieringsstimuli kan være aktive i forskellige kvadranter.
På den forreste side forbliver linseepitelcellerne de eneste mitotisk aktive celler i linsen. De er karakteriseret ved en løbende ekspression af flere Wnt-gener: de detaljerede ekspressionsdata, der er rapporteret, er imidlertid ikke kun forskellige mellem kylling og mus, men varierer også mellem forskellige musestammer (for detaljer, se en gennemgang af de Iongh et al., 2006). Ikke desto mindre står det klart, at Wnt-signalvejens gener udtrykkes overvejende i linsens epitelceller. Det er konsekvent blevet påvist, at Fzd-receptorer (gen-symboler: Fzd1-8) og co-receptorer Lrp5 og Lrp6, Sfrp1-3- og Dkk1-3-gener også udtrykkes under linsens udvikling. De er hovedsageligt til stede i epitelcellerne; den eneste undtagelse er Fzd6, der i stigende grad udtrykkes i differentierende fiberceller (de Iongh et al., 2006). Som et eksempel er lrp6-nulmutanter blevet analyseret og viser (ud over nogle andre defekter; se MGI-database) små øjne og afvigende linser karakteriseret ved et ufuldstændigt dannet forreste epitel, hvilket resulterer i ekstrudering af linsefibre ind i det overliggende hornhindestroma (Stump et al., 2003).
Den vigtigste udløsende faktor for differentiering af linsefiberceller er imidlertid Fgf-signalering. Et af de mest betydningsfulde resultater påviste i rottelinseeksplantater, at forskellige koncentrationer af Fgf2 (tidligere kendt som “basic Fgf” eller “bFGF”) er ansvarlige for linsecelleproliferation, migration og differentiering af linsefiberceller (McAvoy og Chamberlain, 1989). Da det stadig er ukendt, hvilke af de forskellige Fgf’er der er involveret i linseinduktion (Smith et al., 2010), havde forskningen fokuseret på Fgf-receptorerne. Som nævnt ovenfor opstod der alvorlige defekter i linsens fibercellelongation i linser, der manglede tre Fgf-receptorgener (Fgfr1-3; Zhao et al., 2008). Fgf-signalering er også nødvendig for at prime den ikke-kanoniske Wnt-signalvej (dvs, uafhængig af β-catenin) i linseepitelceller; i linseeksplantater fører den til akkumulering af β-crystallin, en markør for fibercelledifferentiering (Lyo og Joo, 2004).
Den modne linse indeholder flere klasser af strukturelle proteiner: krystallinerne (α-, β-, γ-, δ-, μ-, ζ-krystalliner), transmembranproteiner (såsom MP19 og MIP26 og connexinerne 43, 46 og 50), nogle kollagener samt cytoskeletale og intermediære filamentproteiner. Mutationer i de tilsvarende gener (eller specifikke transkriptionsfaktorer) fører til funktionelle ubalancer og linsetæthed (katarakt). Alderen for grå stærs opståen og arveformen afhænger af ekspressionen af de tilsvarende gener og af det område, som er påvirket af den underliggende mutation. I alt ∼60 forskellige gener er kendt for at være ansvarlige for kataraktdannelse hos mus og mennesker. En detaljeret diskussion af de tilsvarende mutationer og deres funktionelle konsekvenser ligger uden for rammerne af dette kapitel; oversigter svarende til dette særlige emne er for nylig blevet offentliggjort af forfatteren (Graw, 2009a,b).