Abstract
Undersøgelserne af arabinoxylan (AX) polysacchariders virkning på postprandial glukose respons har resulteret i kontrasterende resultater på grund af forskelligheden i AX strukturer. Fire vandekstraherbare AX-ekstrakter (WEAX) fremstillet af hvede aleuron og klid blev anvendt til at undersøge (a) effekten af AX på aktiviteter af α-amylase og α-glucosidase, (b) indflydelse af AX kemiske sammensætning på deres hæmningsstyrke og (c) kinetik af enzymhæmning. α-amylaseaktiviteten blev ikke signifikant påvirket af tilstedeværelsen af WEAX-fraktioner uanset type eller koncentration. WEAX hæmmede kun α-glucosidaseaktiviteten, når maltose blev anvendt som substrat, men ikke saccharose. IC50-værdierne for WEAX (- mg/mL) var stærkt korreleret med ferulinsyreindholdet (), forholdet mellem arabinose og xylose () og de relative andele af xylose, der er usubstitueret (), disubstitueret () og monosubstitueret (). Lineweaver-Burk-plottet tydede på en ukompetitiv enzymhæmningsmåde. Vores resultater tyder således på, at WEAX’ antiglykæmiske egenskaber kan være afledt af direkte hæmning af α-glucosidaseaktivitet.
1. Indledning
Forekomsten af type 2-diabetes er stigende globalt set. Diabetes er en kronisk sygdom, der er indbegrebet af højt cirkulerende plasmaglukose. Håndtering af postprandial glukose er således afgørende for forebyggelse og behandling af type 2-diabetespatienter. Interventionsundersøgelser på mennesker har vist, at indtagelse af en arabinoxylan- (AX-) rig diæt mindsker det postprandiale blodglukoseniveau hos raske, personer med nedsat glukosetolerance og diabetikere . I modsætning hertil fandt Mohlig og medarbejdere ingen effekt på glukoseresponset, når raske mennesker blev fodret med brødruller suppleret med AX. Dyreforsøg har også rapporteret om blandede resultater med hensyn til effekten af AX-tilskud . De underliggende mekanismer er fortsat uklare, men det hævdes, at opløselige fibre øger viskositeten i lumen og dermed forsinker absorptionen af næringsstoffer . Den tilsyneladende viskositet af AX-opløsninger påvirkes af AX’ernes asymmetriske konformation og molekylvægt samt af polymerkoncentrationen . Af disse tre faktorer synes koncentrationen af AX at have størst indflydelse på viskositeten . Virkningen af AX’er på blodglukose er således dosisafhængig. AX-opløsningernes tilsyneladende viskositet er også afhængig af forskydningsspændingen, således at højere forskydning resulterer i forskydningstynding, en adfærd, der er karakteristisk for ikke-newtonske væsker . Nyere undersøgelser tyder på, at AX’s viskositetseffekt kan opvejes af stærk intestinal peristaltik.
Den molekylære struktur af AX er kompleks og heterogen. AX’er består af xylanryggen, der består af () bundet β-D-xylopyranosyl (Xylp)-rester med α-L-arabinofuranosyl (Araf)-rester bundet til xylanryggen ved C(O)-2 og C(O)-3 og/eller ved både C(O)-2- og C(O)-3-positioner . Xyloseresterne kan også være substitueret med glucuronsyre- og/eller metylglucuronsyrebindinger . Ferulinsyre- eller cumarinsyreresterrester er esterbundet til arabinoseresterne i C(O)-5-position . Forholdet mellem arabinose og xylose, arabinosesubstitutionens mønster, feruloyleringsgraden og molekylvægten varierer meget mellem og inden for kornsorterne . Arabinoxylaner (AX) udgør den største andel af kostfibre i kornsorter (60-70 %), og deres indhold varierer alt efter kornkilde eller kornfraktion. AX udgør 1,3-2,7 % w/w i hvede . Hvedens aleuron og pericarp indeholder henholdsvis 20 og 45 % AX . En stor del af AX’erne i hvede er uopløselige i vand (70-86 %) .
Diæt fordøjelige kulhydrater hydrolyseres til de monomere sukkerarter, glukose eller fruktose, før de optages i mave-tarmkanalen . Stivelse fordøjes primært til maltose og andre kortkædede kulhydrater af spyt- og bugspytkirtelamylase. De resulterende (maltose, maltotriose og α-grænse dextriner) og saccharose fordøjes til glucose eller fructose af de α-glucosidaser (maltase-glucoamylase og saccharose-isomaltase), der findes i tyndtarmens børstebrystgrænse, til glucose eller fructose . Sukkeroptagelsen i tyndtarmen involverer hovedsagelig GLUT2-, GLUT5- og SGLT1-transportører . Der kan således opnås et fald i postprandial hyperglykæmi ved at begrænse tarmens kulhydratfordøjelse eller -optagelse. På trods af de enorme forskelle i AX’s struktur rapporterer de fleste undersøgelser kun meget få eller ingen detaljer om sammensætningen eller strukturen af den anvendte AX, hvilket gør det vanskeligt at sammenligne resultaterne af AX’s virkning på postprandial blodglukose . Der findes også meget begrænsede data om virkningen af AX’er, der kan ekstraheres med renset vand, på kulhydratfordøjelsesenzymerne. I denne undersøgelse havde vi således til formål at undersøge (a) virkningen af AX på aktiviteterne af α-amylase og α-glucosidase, (b) indflydelsen af AX’s kemiske sammensætning på deres hæmningsstyrke og (c) kinetikken af enzymhæmning.
2. Materialer og metoder
2.1. Kemikalier og reagenser
En kommerciel hvede aleurone (Grainwise hvede aleurone) var en gave fra Cargill Limited og Horizon Milling (Wichita, Kansas, USA). Den består af henholdsvis 4,5, 15,2, 7,4 og 2,5 % lipid, protein, aske og stivelse. Klid af hård rød vinterhvede blev købt lokalt hos Bulk Barn (Winnipeg, Manitoba, Canada). Dens vand-, aske- og proteinindhold blev analyseret til henholdsvis 5,8, 5,3 og 11,1 %. Umodificeret hvedestivelse, maltose, saccharose, acarbose, α-amylase fra svinepankreas (EC 3.2.1.1.1, type VI-B), amyloglucosidase (EC 3.2.1.3) fra aspergillus og tarmacetonpulver fra rotter blev købt hos Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Ammoniumsulfat, alle syrer og organiske opløsningsmidler blev købt hos Fischer Scientific (Whitby, Ontario, Canada). Maltose-, saccharose- og glukoseanalysesættet (K-MASUG 08/13) blev købt fra Megazyme International Ireland (Bray, Wicklow, Irland). Alle anvendte kemikalier var af analytisk eller HPLC-kvalitet.
2.2. Fremstilling af vandekstraherbart arabinoxylan
De endogene enzymer blev inaktiveret ved at koge hvedeklid og hvede aleuronprøver (~200 g) i 2 L vandig ethanol (80%, v/v) ved 85°C under reflux i 2 timer. Overnatanten blev kasseret, og restproduktet blev lufttørret i en damphætte natten over ved stuetemperatur. Fraktioner, der kan ekstraheres med vand, blev isoleret fra den lufttørrede klid eller aleuron (150 g) ved 45 °C efter den metode, der er beskrevet af Izydorczyk og Biliaderis . Vandekstraktet blev destarket ved hjælp af α-amylase (1821 U/L) og deproteiniseret ved hjælp af celit og fuller’s earth. Det rensede materiale blev fraktioneret ved gradueret ammoniumsulfat (AS)-udfældning, og der blev opnået fraktioner ved 50 og 75 % AS-mætning. Det indsamlede materiale blev frysetørret efter at være blevet dialyseret (12 kDa cut-off membran) i 48 timer. De vandekstraherbare fraktioner, der er indsamlet fra hvede aleuron, blev mærket (WA) efterfulgt af den koncentration af AS, ved hvilken de blev opnået (WA-f50 og WA-f75). På samme måde blev de indsamlede materialer fra hvedeklid (WB) betegnet som WB-f50 og WB-f75. De kemiske og strukturelle beskrivelser af WEAX-fraktionerne er anført i tabel 1.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Værdier præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (). Un-Xylp: usubstituerede xylose-rester, mono-Xylp: monosubstituerede xylose-rester,di-Xylp: WA-f50 og WA-f75: vandekstraherbare fraktioner fra WA opnået ved henholdsvis 50 og 75 % mætning af ammoniumsulfat. WB-f50 og WB-f75: vandekstraherbar fra WB opnået ved henholdsvis 50 og 75 % ammoniumsulfatmætning. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.3. Hæmningsassay for α-amylaseaktivitet
Hvedestivelse (300 mg) blev suspenderet i 15 mL natriumphosphatbuffer (pH 6,9, 0,1 M) indeholdende 1 mM calciumklorid og kogt ved 95°C i 15 minutter . WEAX-fraktioner (40 mg) blev opløst i 2 mL natriumphosphatbuffer. Prøverne blev fortyndet således, at den endelige koncentration i reaktionsblandingen var 0,0, 0,2, 0,3 og 0,5% (w/v). Lige store mængder (200 μL) af stivelse og WEAX (eller kontrol) blev blandet og hvirvlet. Stivelseshydrolysen blev indledt ved at tilsætte 70 μL α-amylase fra pancreas fra svin (130 U/mL) og 40 μL amyloglucosidase fra svampe (240 U/mL). Reaktionen blev stoppet efter 30 minutter ved opvarmning ved 95 °C i 5 minutter. Blandingen blev straks afkølet på is og centrifugeret (Thermo Scientific, Sorvall Legend Micro21, Tyskland). Supernatanterne blev opsamlet og analyseret for glukose ved hjælp af Megazyme glukosetestkit. Undersøgelser af menneskelig intervention har rapporteret om effektiviteten af en AX-koncentration på 0,25 til 0,70 %, og derfor valgte vi dette koncentrationsområde.
2,4. Hæmningsassay for α-glucosidaseaktivitet i tarmene hos rotte
Den α-glucosidasehæmmende metode af Oki et al. blev anvendt med modifikationer. Kort fortalt blev rottetarmens acetonepulver (500 mg) blandet med 10 mL natriumphosphatbuffer (pH 6,9, 0,1 M) og soniceret i isbad i 30 sekunder (12 gange) med 15 sekunders pause for at forhindre varmeopbygning. Blandingen blev senere centrifugeret ved 10000 ved 4°C i 10 minutter. Supernatanten blev opsamlet og mærket med rottetarmens α-glucosidase. WEAX-prøver (40 mg) blev opløst i 2 mL natriumphosphatbuffer (pH 6,9, 0,1 M). Senere blev 50 μL α-glucosidase fra rottetarm blandet med 100 μL prøve eller buffer (kontrol) og inkuberet ved 37 °C i 5 minutter. Halvtreds μL 20 mM saccharose eller 4 mM maltose blev tilsat og yderligere inkuberet i 60 minutter (saccharose) eller 30 minutter (maltose). Den endelige WEAX-fraktionskoncentration var 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 og 0,0 % (w/v). Enzymaktiviteten blev standset ved opvarmning ved 95 °C i 10 minutter. Efter centrifugering ved 10000 i 10 minutter blev supernatanterne opsamlet til glucoseanalyse ved hjælp af Megazyme GOPOD glucose-testsættet. Hæmningsprocenten af alfa-glucosidase (sucrase eller maltase) blev beregnet som . IC50-værdien blev bestemt ud fra plottet af % α-glucosidasehæmning i forhold til prøvekoncentrationen. Hæmning af α-glucosidase fra rottetarm med acarbose (en kendt α-glucosidasehæmmer) blev også foretaget til sammenligning. Der blev anvendt acarbosekoncentrationer på 1,625, 3,25, 4,9, 6,5, 9,8 og 13 μg/mL i stedet for prøven.
2,5. Statistisk analyse
Alle analyser blev udført i sextuplikat (medmindre andet er angivet), og alle statistikker blev beregnet ved hjælp af envejs variansanalyse (ANOVA) på en JMP 12 statistisk software (SAS Institute Inc., Cary, NC). Prøvens gennemsnit blev sammenlignet ved hjælp af Tukey HSD-metoden, og signifikante forskelle blev bestemt ved . Korrelationer mellem parametre blev beregnet ved hjælp af Pearsons korrelationstest.
3. Resultater og diskussion
Virkningerne af WEAX på stivelseshydrolyse er vist i figur 1. Vi sammenlignede mængden af glukose, der blev frigivet i løbet af 30 minutters inkubation med α-amylase i tilstedeværelse eller fravær af WEAX-fraktioner. Tilsætning af WEAX-fraktioner mindskede numerisk mængden af glukose produceret sammenlignet med kontrolbehandling. Statistiske sammenligninger af behandlingsgrupper og kontrol viste imidlertid, at den gennemsnitlige forskel ikke var signifikant () for WA-f50, WA-f75 og WB-f75 uanset WEAX-koncentrationen. Tilstedeværelsen af 0,5 % WB-f50 resulterede i et signifikant fald i amylolysen sammenlignet med kontrol (). Vores observationer for alfa-amylaseaktivitet stod imidlertid i kontrast til andre rapporter i litteraturen, muligvis på grund af koncentrationen og typen af AX. Amylolyse af stivelse blev udført i tilstedeværelse af 1 og 2 % AX, og den anvendte AX var uden ferulinsyre . Vi anvendte koncentrationer af AX (~5-10 g) svarende til den koncentration, der er rapporteret til at dæmpe postprandial blodglukose i undersøgelser på mennesker .
Tabel 2 viser effekten af WEAX på α-glucosidaseaktiviteten i tilstedeværelse af saccharose eller maltose som substrat. Dataene er præsenteret som IC50, som er den koncentration af inhibitoren, der resulterer i 50 % hæmning af α-glucosidaseaktiviteten. IC50-værdierne varierede fra 4,88-10,14 mg/mL mod α-glucosidaseaktivitet med maltose som substrat. Der blev imidlertid ikke observeret nogen hæmning, når saccharose blev anvendt som substrat. Den hæmmende styrke af WEAX mod intestinal maltase var 1000-2000 gange mindre sammenlignet med acarbose (en positiv kontrol). Det er en udbredt hypotese, at viskositet kan være årsagen til AX’s virkning på postprandial glukose . Vogel et al. fodrede derfor rotter med en modificeret AX med hvedeklid for at undersøge virkningen af viskositet . Hæmning af tarmens alfa-glucosidase af AX-mono-/oligosaccharider var også relateret til deres ferulinsyreelement . WA-f50 og WB-f75 havde således signifikant forskellig hæmningsstyrke over for α-glucosidaseaktivitet til trods for, at de havde samme relative andel af usubstituerede (un-Xylp), monosubstituerede (2-Xylp eller 3-Xylp) og disubstituerede xylose-rester (2,3-Xylp) og substitutionsgrad, men forskelligt ferulinsyreindhold.
|
|||||||||||||||||||||||||||||
| Data repræsenterer Pearson-korrelationskoefficientværdier ved . un-Xylp: usubstituerede xylose-rester, mono-Xylp: monosubstituerede xylose-rester, di-Xylp: C (O)-2 og C (O)-3 disubstituerede xylose-rester. | |||||||||||||||||||||||||||||
Arabinose til xylose-forholdet er et mål for substitutionsgrad (DS). Der blev observeret en stærk negativ lineær sammenhæng ( = -0,67) mellem DS og IC50. Dette kan have været en konsekvens af øget opløselighed af AX som følge af høj DS. Højtsubstitueret WEAX synes således at have en lavere IC50-værdi (høj hæmningseffekt). Den samme observation blev understøttet af den negative sammenhæng mellem hæmningsstyrke og den relative andel af usubstituerede xylose-rester. Det tilsyneladende forhold mellem di-Xyl- og mono-Xylrester synes ikke at have nogen indflydelse, men omfanget af xylose-substitution viste en effekt. Det er således sandsynligt, at virkningen på α-glucosidaseaktiviteten kan stamme fra arabinoseresterne i WEAX. Der har været rapporteret om arabinose, der hæmmer α-glucosidaseaktiviteten . Forsøg på at fjerne arabinoseresterne fra WEAX ved hjælp af arabinofuranosidase var ikke vellykkede med henblik på at bevise hypotesen. Vi bemærkede imidlertid, at mono-Xyl ved C (O)-2 var en vigtig determinant sammenlignet med mono-Xyl ved C (O)-3, hvilket tyder på, at hæmningsstyrken var mere end den blotte tilstedeværelse af arabinoserester. Der var en stærk korrelation mellem mono-Xyl ved C (O)-2 og ferulinsyreindholdet ( = 0,99). Det er således muligt, at den observerede indflydelse af DS kunne være afledt af ferulinsyre.
Lineweaver-Burk-plottet (figur 2) blev anvendt til at beregne den tilsyneladende maksimale hastighed () og Michaelis-Menten-konstanten () for α-glucosidaseaktivitet på maltose i tilstedeværelse og fravær af WEAX. Effekten af WEAX-fraktionen på og blev analyseret for at bestemme hæmningstypen. og af α-glucosidase for maltose i fravær af WEAX-fraktioner var henholdsvis 17,5 μg glucose pr. minut og 5,99 mM. Tabel 4 viser, at tilsætning af WEAX-fraktioner mindskede begge og værdier, hvilket tyder på, at WEAX hæmmer α-glucosidaseaktiviteten gennem en ukompetitiv metode. Et typisk kendetegn ved ukompetitiv hæmning er, at både og falder ved tilstedeværelsen af inhibitor. Det er således plausibelt, at WEAX-fraktioner binder sig til enzymsubstratkomplekset og derved mindsker både og . Arabinose blev også fundet at hæmme α-glucosidaseaktiviteten på en ukompetitiv måde .
|
|||||||||||||||||||||||||||||
| Værdierne angives som middelværdi ± standardafvigelse (). Data i samme kolonne med samme overskrift er ikke signifikant forskellige ved . = maksimal hastighed; er Michalelis-Menten-konstanten (substratkoncentration, der kræves, for at et enzym kan nå halvdelen ). nd betyder ikke bestemt. WA-f50 og WA-f75: vandekstraherbare fraktioner fra WA opnået ved henholdsvis 50 og 75 % ammoniumsulfatmætning. WB-f50 og WB-f75: vandekstraherbare fraktioner fra WB opnået ved henholdsvis 50 og 75 % ammoniumsulfatmætning. | |||||||||||||||||||||||||||||
Vores resultater kan give en forklaring på den uoverensstemmelse, der er observeret i litteraturen om effekten af AX på det postprandiale glukoseniveau. Fodring af Zuker diabetiske rotter med AX (Ara/Xyl = 0,9) suppleret brød resulterede i et signifikant fald i det postprandiale blodglukoseniveau . I modsætning hertil havde indtagelse af naturlig AX (Ara/Xyl = 0,5) ingen virkning på blodglukoseresponset . Også tilskud af kost med 6 og 12 g AX (Ara/Xyl = 0,66 eller 0,8) reducerede blodglukose hos både raske og diabetiske personer . AX (Ara/Xyl = 0,8) dæmpede imidlertid ikke den postprandiale glukosereaktion hos raske voksne mennesker . Svin, der blev fodret med hvidt brød suppleret med AX’er, havde en reduceret nettoglukoseflux sammenlignet med svin, der blev fodret med hvidt brød . Manglen på detaljerede oplysninger om kemisk sammensætning og struktur gør det vanskeligt at sammenligne resultaterne vedrørende AX’s effektivitet. Selv om koncentrationerne af de anvendte AX’er kan være de samme, vil deres effektivitet således afhænge af arten af de anvendte AX’er. Vi har påvist, at AX fremstillet ved 50% ammoniumsulfatmætning udviste en højere hæmningseffekt sammenlignet med AX fremstillet ved 75%.
4. Konklusion
Resultaterne af denne undersøgelse indikerede, at arabinoxylans antiglykæmiske virkning kan stamme fra hæmning af tarmens α-glucosidaseaktivitet, men ikke fra amylaseaktivitet. Styrken af vandekstraherbar AX på α-glucosidaseaktivitet blev påvirket af ferulinsyreindholdet arabinose til xylose-forholdet og mønsteret af xylose-substitution. Resultaterne tyder også på, at hæmning af α-glucosidaseaktivitet sker gennem en ukompetitiv mekanisme. Således kan indtagelse af kost rig på vandekstraherbar AX dæmpe det postprandiale blodglukoseniveau.
Oplysning
En del af resultaterne blev præsenteret som en mundtlig plakat på symposiet Functional Foods and Natural Health Products Graduate Research (FFNHP) symposium/Therapeutic Applications of Functional Foods and Bioactives (TAFFB) konference, der blev afholdt på St-Boniface Hospital Albrechtsen Research Centre fra den 20. til 22. april 2016.
Interessekonflikter
Alle modtagne midler eller materiel støtte førte ikke til interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af dette manuskript.
Akkreditering
Denne forskning blev finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) gennem Discovery Grant Programme. Forfatterne er også taknemmelige over for Cargill Limited for tilvejebringelse af hvede aleuronprøver og Ce Zhou, Alison Ser og Pat Kenyon fra Department of Food Science, University of Manitoba, for deres tekniske støtte.