12. maj 2018
Et almindeligt spørgsmål, som forskere altid stiller, når de får et signal fra et antistofbaseret assay, er: “Repræsenterer dette signal virkelig tilstedeværelsen og mængden af mit protein?”
Antistofspecificitet er altid en bekymring for forskere. Selv om der findes en række valideringsmetoder, der er blevet anvendt til testning af specificitet, overfortolkes dataene ofte. Forskningsdata fra forskellige grupper har vist, at nogle af de monoklonale antistoffer, der anvendes på markedet, faktisk ikke er monospecifikke. De kan krydsreagere med andre proteiner, og krydsreaktiviteten kan vildlede forskerne med falske positive resultater og potentielt forårsage uventede bivirkninger og falske diagnostiske rapporter for klinikere.
Så hvilke kontroller bør vi bruge til validering af antistofspecificitet?
Cellelinjer og væv, der udtrykker målproteinerne i store mængder, kan bruges som positive kontroller til antistofvalidering.Det kan være endogent protein eller overeksprimeret protein, der er kodet af en cDNA-klon. Positiv kontrol vil dog ikke kunne bekræfte antistoffets specificitet. Man kan se et bånd i den korrekte størrelse eller en positiv farvning på den rigtige subcellulære placering, men det kan alle være falske positive signaler fra antistoffets krydsreaktivitet. Så normalt er der til validering af antistoffer brug for en negativ kontrol til vurdering af uspecifik binding.
Knockout-validering er indtil videre den bedste negative kontrol til vurdering af antistofspecificitet. Ved knockout-validering testes antistoffet på en knockout-cellelinje, som ikke udtrykker målproteinet. Fra 2017 har OriGene slået sig sammen med EdiGene, en CRISPR-innovatør, for at producere dobbelt-knockout-celler på en høj-gennemgangsmåde. I modsætning til knockoutcellelinjen fra Horizon er OriGene knockoutcellelinjerne fra de almindeligt anvendte cellelinjer, såsom HEK293T eller HeLa, hvilket gør produktet mere relevant for forskere.I denne dobbelte knockoutcellelinje er antistofmålet ikke til stede, da det gen, der koder for proteinet, er elimineret eller “knockoutet ud”. Prøver fra knockoutceller og forældreceller (wild type) testes side om side mod det samme antistof, og hvis antistoffet virkelig er specifikt, bør det kun detektere det specifikke signal i wild type-cellen, men ikke i knockoutcellelinjen. Ved hjælp af lysaterne fra disse knockoutceller har vi valideret mere end 100 monoklonale antistoffer (KO-validerede antistoffer). Knockout-validering anses for at være en ægte negativ kontrol for testning af antistofspecificitet.
Men er knockout-validering nok til at bekræfte et antistofs monospecificitet? Jeg vil være forsigtig med denne konklusion.For det første er virkningerne af knockout-celler uden for målgruppen ikke velundersøgt på nuværende tidspunkt. Så en knockout-celle kan ikke blot eliminere ekspressionen af det pågældende protein, men også eliminere eller reducere ekspressionen af et andet protein, som kan være et protein, der krydsreagerer med antistoffet. Så det negative signal betyder ikke altid, at antistoffet ikke vil reagere med andre proteiner end det pågældende protein. For det andet er det kun muligt at teste med knockout-celler/væv for de ikke-essentielle proteiner. For de essentielle proteiner er knockout umuligt. Så for disse proteiner har man brug for en anden måde at teste antistoffets specificitet på.
For nogle år siden udviklede OriGene en proteinarray-metode til test af antistofspecificitet. Med verdens største samling af overeksprimeringslysater har vi fremstillet en unik proteinchip, der indeholder >10k overeksprimerede humane proteiner i to eksemplarer på et enkelt nitrocellulosebelagt glasobjekt. Denne proteinmikroarray-teknologi er blevet brugt til at validere specificiteten af mange OriGeneUltraMAB™ monoklonale antistoffer. Ved at øge antallet af proteiner på chippen kan et antistofs krydsreaktivitet undersøges yderligere på tværs af hele det menneskelige proteasom.
Sammenfattende er det ret kompliceret at teste antistofspecificitet. Den skal valideres ved hjælp af flere værktøjer og retninger. efterhånden som teknologien fortsætter med at udvikle sig, vil vi få flere værdifulde aktiver og standardiserede procedurer for validering af antistoffer. forskerne vil ikke stå over for det samme spørgsmål, når de får positive signaler fra deres antistofbaserede assays.