Asymmetrisk syntese af batrachotoxin: Enantiomeriske toksiner viser funktionel divergens mod NaV

Den fænotypiske virkning af akutte giftstoffer, der findes blandt det rige farmakopé af land- og havliv, er blevet dokumenteret siden oldtiden. Isolering og karakterisering af giftige forbindelser har gjort vigtige kemiske reagenser til rådighed til undersøgelse af komplekse biokemiske kredsløb (1). Undersøgelser af denne type har afsløret et stort antal peptid- og småmolekylære stoffer, der er målrettet mod spændingsregulerede natriumionkanaler (NaV’er), en obligatorisk klasse af membranproteiner for bioelektrisk signalering (1-4). Blandt samlingen af kendte NaV-modulatorer er tre strukturelt beslægtede midler, (-)-batrachotoxin , veratridin og aconitin (Fig. 1A) – sterisk store, lipofile aminderivater, som menes at dele et fælles bindingslokus i NaV’s indre poreregion (3) (sted 2, Fig. 1B). Indflydelsen af disse toksiner på ion-gating adskiller sig imidlertid markant. På den ene side er (-)-BTX, den primære giftige bestanddel af colombianske giftpilefrøer (slægten Phyllobates), en fuld NaV-agonist, der får kanalen til at åbne lettere ved hyperpolariserede membranpotentialer og blokerer for hurtig inaktivering (blandt andre karakteristiske virkninger) (3-5). Omvendt kan aktiviteterne af veratridin og aconitin bedst beskrives som henholdsvis delvis agonisme og hæmning af kanalfunktionen (5). På trods af nyere indsigt fra strukturbiologien i den tredimensionelle arkitektur af prokaryote NaV’er (6-9) mangler der en molekylær forståelse af sted 2-toksinernes indflydelse på ionledning og kinetik for ion-gating. Undersøgelser af toksinstruktur-aktivitet i kombination med proteinmutageneseeksperimenter kan løse spørgsmål vedrørende kanalfunktionens dynamiske natur og kan vejlede i den rationelle udformning af småmolekylære modulatorer af NaV-aktivitet (1). Styrken af (-)-BTX (10), dets historiske historie som den arketypiske småmolekylære site 2-sonde (4) og dets uovertrufne virkninger på kanalgating gør det til en optimal “lead”-forbindelse til sådanne undersøgelser.

(-)-BTX-binding til NaVs ændrer alle aspekter af kanalfunktionen, hvilket resulterer i en hyperpolariseret forskydning i aktiveringens spændingsafhængighed, hæmning af både hurtig og langsom inaktivering, et fald i enkeltkanalkonduktans og reduktion af ion-selektivitet (3, 4). Nytteværdien af dette naturprodukt som NaV-aktivator har ført til en betydelig udtømning af verdensforsyningen, som engang oversteg 1 g, men som i 2009 var mindre end 170 mg (11, 12). Siden giften først blev isoleret i 1963 af Märki og Witkop fra giftige frøer indsamlet i Colombias nordlige regnskov (13), er Phyllobates blevet opført på listen over truede arter, og indsamling af naturlig (-)-BTX fra denne kilde er derfor begrænset. (-)-BTX er også blevet identificeret i udvalgte arter af fugle (slægterne Pitohui og Ifrita) (14) og biller (slægten Choresine) (15), men kun i små mængder (f.eks. ~1,8 μg (-)-BTX pr. bille). Selv om der er blevet offentliggjort semi- (16) og racemiske synteser (17) af BTX-A (fig. 1C), en forbindelse, der mangler C-20 pyrrolesteren, udelukker længden af hvert af disse værker (>45 lineære trin) en nem fremstilling af (-)-BTX eller udvalgte analoger. Følgelig har vores ønske om at bruge BTX og modificerede former heraf til undersøgelse af kanaldynamik og ion-gating-mekanismer motiveret vores bestræbelser på at opnå naturproduktet gennem de novo-syntese.

Retrosyntetisk analyse af (-)-BTX førte os til at skitsere en plan, der ville muliggøre sen samling af homomorpholin E-ringen og udarbejdelse af C-20 allylester (Fig. 1C) og derved lette adgangen til modificerede former af toksinet. Tidligere struktur-aktivitetsforholdsundersøgelser ved hjælp af et lille antal semisyntetiske BTX-derivater (10, 18) og C/D/E-ring BTX-analoger (19) afslørede betydningen af C-20-esteren, tertiær amin og det tetracykliske skelet for NaV-agonistaktivitet. Ved at optrævle BTX-A afsløres en steroidlignende ramme 1, hvis samling er forvirret af to vinkelgrupper ved C/D-ringforbindelsen, C-11 exo-methylen og C-8/C-9 alken. For at maksimere konvergensen i vores syntetiske plan udtænkte vi en afbrydelsesstrategi for 1 på tværs af C-ringen. Denne idé ville reducere problemet med at konstruere 1 i to fragmenter, hvoraf det ene ville udtrykke A/B-ringssystemet (3, 20) og det andet ville omfatte D-ringens cyclopentan (4, 21). En vellykket gennemførelse af dette skema kunne producere det ønskede toksin gennem en sekvens af lineære trin på i alt ikke mere end 20 til 25.

Vores syntese af (-)-BTX begyndte med kobling af methylencyclopentanon 4 (21) (fig. S1A) og vinylbromid 3, der blev opnået fra (S)-(+)-Hajos-Parrish keton gennem en modificeret sekvens af trin, der oprindeligt blev skitseret af Parsons og kolleger (20) (fig. S1B). Sammenføjning af fragmenterne 3 og 4 for at generere den sammenkoblede A/B/D-tricykel 5 udgjorde den første i en række udfordringer i forbindelse med procesudvikling. Et første forsøg på at gennemføre denne omdannelse omfattede Li-Br-udveksling af 3 med n-BuLi (Bu, butyl) og sekventiel tilsætning af enon 4. Selv om 5 blev leveret under disse betingelser, var produktudbyttet aldrig over 30%. Deuteriumquenchingeksperimenter med D2O validerede vores hypotese, at α-deprotonering af 4 var konkurrencedygtig med den ønskede ketonadditionsvej. Transmetalieringsreaktioner af vinyl-lithium-arter med ZnCl2, ZnBr2, MgBr2-OEt2 (Et, ethyl), CeCl3, Yb(OTf)3 (Tf, trifluormethansulfonat), CeCl3-2LiCl og LaCl3-2LiCl blev undersøgt, men ingen af disse foranstaltninger viste sig effektive (22, 23). Tilsætning af en ækvivalent vandfri LiBr til reaktionsmediet for 3 forbedrede koblingseffektiviteten med >20% (24). Efter dette spor gav en optimeret protokol med anvendelse af 2,1 ækvivalenter t-BuLi, som formodentlig genererer en ækvivalent LiBr in situ, reproducerbart 5 som en enkelt diastereomer i 65% udbytte på en multigramskala. Den lette syntese af dette materiale og dets desilylerede form 6 muliggjorde efterfølgende bestræbelser på at identificere betingelser for tandemannulering af C-ringen og installation af det kvaternære C-13-center.

En evaluering af tilgængelige metoder til ringlukning af 1,6-enynes førte os til at overveje radikalt initierede processer (25). Under sådanne betingelser kunne et begyndende C-13 3°-radikal opfanges for at smede den kantede aminomethylen-enhed (eller et egnet surrogat). Forsøg på først at undersøge C-ringdannelse på 6 afslørede imidlertid den potentielle fejltagelse af denne plan. Anvendelse af n-Bu3SnH og triethylboran (Et3B) til at fremme cykliseringsbegivenheden resulterede i dannelsen af to isomerer, 7 og 8, i et 1:5 forhold, der favoriserer det uønskede produkt (Fig. 2A). Undersøgelser foretaget af Stork og Beckwith og medarbejdere har vist, at substratkoncentration og reaktionstemperatur kan påvirke cykliseringsmåden (dvs. 5-exo-trig versus 6-endo-trig) i radikalmedierede enyne-reaktioner (26, 27). Ved forhøjet temperatur (130°C) og med femdobbelt fortynding af 6 blev der observeret en omvendt selektivitet, hvilket gav et lille overskud af den ønskede tetracyklus (1,3:1 forhold mellem 7 og 8; Fig. 2A). Det samlede produktudbytte af denne omdannelse oversteg 90%, hvilket tilskynder til yderligere udforskning af denne kemi på trods af de beskedne selektivitetsresultater.

Gentagne forsøg på at indfange det intermediære C-13-radikal med oxim- og hydrazonderivater genereret fra formaldehyd gav ikke det forventede aminomethyleringsprodukt (28). Tvunget til at overveje alternative løsninger, erkendte vi, at en modificeret silylethergruppe knyttet fra den tilstødende C-14 alkohol ville være passende placeret til at opfange 3°-radikalet (29). Baseret på tilgængelige fortilfælde blev et alkynylsilylchlorid, Me3SiC≡CSiEt2Cl (Me, methyl), valgt til modifikation af C-14-alkoholen i 6 (30, Fig. 2A). Behandling af den resulterende silylether (9) med n-Bu3SnH og Et3B ved 150°C resulterede i en cykliseringskaskade for at give pentacykel 10 som det eksklusive produkt (31). Inden for grænserne af protonkernemagnetisk resonans (1H NMR)-detektion blev ingen af de tilsvarende femledede C-ringisomerer dannet i denne proces. Vores foreløbige bestræbelser på at forstå den rolle, som C-14 substituentgrupper spiller for reaktionsselektiviteten, tyder på, at silylbeskyttelse af alkoholen (sammen med de forhøjede reaktionstemperaturer) begunstiger 6-endo-trig ringlukning. Selv om yderligere undersøgelser er berettigede for at værdsætte disse struktur-selektivitetsdata, tilbyder vores enynecykliseringskaskade en konvergent tilgang til syntese af substituerede steroid-stilladser og bør lette adgangen til en bred vifte af sådanne forbindelser.

Nærmere inspektion af de radikale cykliseringsprodukter, der er afledt af enten 6 eller 9, afslørede et uventet resultat vedrørende strukturen af den resulterende organostannan-del (Fig. 2, A og B). Carbostannylering af alkyne-gruppen skulle give et vinyl-tin-produkt, som det blev bemærket ved reaktionen af 6. Uventet var allylstannan 10 det eneste produkt, da 9 blev underkastet reaktionsbetingelserne, hvilket blev bekræftet af både NMR og røntgenkrystallografi. Dannelse af allylstannan 10 kan rationaliseres gennem en mekanisme, der involverer 1,4-H-atomoverførsel af et mellemliggende vinylradikal (32) (fig. 2B), et forslag, der understøttes af et deuteriummærkningseksperiment (fig. S5). Selv om dette resultat var uplanlagt, tvang effektiviteten og selektiviteten af cykliseringsreaktionen vores beslutning om at fremme dette materiale. Fremadrettet bør alsidigheden af allylstannangruppen tjene fremtidige bestræbelser på at fremstille C ringmodificerede BTX’er.

Den tilgængelige 10 i ni trin fra Hajos-Parrish ketonen gjorde det muligt at fremstille betydelige mængder af materiale til at fuldføre målsyntesen. Eksklusion af den brobyggende silylether i 10 blev udført med overskydende n-Bu4NF, hvilket afslørede et diolintermediat, der efterfølgende blev fremskyndet til 11 gennem 2-iodoxybenzoesyre-medieret alkoholoxidation og kemoselektiv vinylsilankspaltning (57%; Fig. 2B). Konverteringen af aldehyd 11 til chloroacetamid 12 blev udført ved at følge en tretrins sekvens i et enkelt kolbe (16, 33). Fra 12 gav en effektiv lukning af homomorpholinamidringen med NaOEt (92%) (17) et alsidigt mellemprodukt til modifikation af både C- og D-ringenhederne. Sidstnævnte kunne opnås gennem D-ringens enoltriflat, fremstillet ved hjælp af KN(SiMe3)2 og PhNTf2.

Introduktion af C-11α-alkoholen fra C-ringens allylstannan 13 udgjorde en af de vanskeligere udfordringer i vores tilgang til BTX (fig. 2B). Selv om protodestannylering af 13 for at generere den tilsvarende C-11 exo-methylencyclohexan havde begrænset succes (34), gav alle efterfølgende forsøg på at oxidere denne forbindelse til keton 15 (dvs. O3, OsO4 og RuO4) ikke produkt. Inspireret af en rapport fra Kim og Fuchs forsøgte vi at omdanne 13 til det tilsvarende allylchlorid ved hjælp af CuCl2 (35). Heldigvis gav udførelse af denne reaktion i dioxan under aerobe forhold enal 14 i 85% udbytte med kun en mindre mængde af det klorerede produkt (~10%). Selv om de mekanistiske detaljer i denne omdannelse fortsat er uklare, kender vi kun til ét andet dokumenteret eksempel på en sådan oxidationsreaktion, som anvender en vanadiumkatalysator og O2 (36). Enal 14 er velegnet til omdannelse til C-11 keton 15 ved at følge en række trin til omdannelse af funktionelle grupper, som fremhæves af en Curtius-omlægning (37). Fraværet af en levedygtig chromophor på batrachotoxin A (BTX-A) gør det vanskeligt at rense dette materiale; i den sekvens, der fører til 15, blev C-3-methoxyacetalen derfor udskiftet med p-methoxyphenethylalkohol.

Fuldstændiggørelse af kulstofskeletet af (-)-BTX blev opnået gennem en palladiumkatalyseret krydskobling af tributyl(1-ethoxyvinyl)tin til vinyltriflat 15 (fig. 3A) (38). In situ hydrolyse af den begyndende enolether med 1 M oxalsyre gav enon 16 (77%). Efter en omfattende screening af reduktionsmidler blev der opnået en vellykket stereoselektiv global reduktion af enon 16 i 33% udbytte ved behandling med frisk fremstillet AlH3 (39). Vi antager, at den Lewis-basiske lactam (eller en reduceret form) fungerer som et centralt stereokontrollerende element, da behandling af enon 15 med alternative hydridreduktionsmidler udelukkende gav den uønskede C-11β-alkohol. Brugen af AlH3 favoriserede også generering af den korrekte C-20 allylic alkohol epimer, et sterokemisk resultat, som kan rationaliseres gennem en model, der påberåber sig chelationskontrol (38). Deprotektion af produktet fra AlH3-reduktion under sure forhold gav (-)-BTX-A i 83 % udbytte (17). Endelig blev ved anvendelse af en modifikation af Tokuyama, Daly og Witkop’s (-)-BTX-A acyleringsprotokol med det blandede anhydrid fremstillet af ethylchlorformiat og 2,4-dimethyl-pyrrol-3-carboxylsyre (10), syntesen af 2 mg (-)-BTX gennemført (79%, 0,25% samlet udbytte) i 24 trin fra (S)-(+)-Hajos-Parish keton. Produktet var i alle henseender identisk med en prøve af det naturlige materiale og med tidligere registrerede spektroskopiske data (40, 41). Vores synteseplan muliggjorde også fremstilling i milligramskala af det unaturlige toksins antipode, (+)-BTX, den kendte benzoatester af (-)-BTX-A (BTX-B; fig. 3B) (42, 43) og enantiomeren af denne forbindelse (ent-BTX-B).

Elektrofysiologisk karakterisering af syntetisk (-)-BTX og BTX-B mod NaV1.4 hos rotte (rNaV1.4) bekræftede, at sidstnævnte også fungerer som agonist og har samme styrke som det naturlige produkt (fig. S6 og tabel S12). Tidligere rapporter og vores egne undersøgelser tyder på, at estergruppen i BTX-B er mere stabil end BTX’s oxidativt følsomme acylpyrrol; derfor blev der udført yderligere eksperimenter med førstnævnte forbindelse (42, 43). Syntetisk BTX-B blev testet mod en undergruppe af repræsentative NaV isoformer, herunder rNaV1.4, human NaV1.5 og human NaV1.7. Anvendelse af 10 μM BTX-B på kinesiske hamster ovarieceller, der udtrykker en enkelt NaV-subtype, resulterede i vedvarende natriumstrøm i alle tilfælde (fig. 4A og fig. S7 og S8). Brugsafhængig agonisme af NaV isoformer med BTX-B forhindrede steady-state inaktivering af >80% af natriumkanalpopulationen (Fig. 4A og fig. S8). BTX-B inducerede også et karakteristisk hyperpolariserende skift (-44,9 til -51,5 mV) i den halvmaksimale spænding (V0,5) for aktivering af wild-type NaV-isoformer (fig. 4B og tabel S13). Ligheden af disse data er i overensstemmelse med den høje proteinsekvensbevaring mellem NaV-subtyperne i de indre porebeklædte S6-helixer, der danner det formodede toksinbindingssted (fig. S9).

I forlængelse af tidligere arbejde fra vores laboratorium (19) og andre (44, 45) stillede vi spørgsmålstegn ved, om den enantiomerform af BTX ville binde med høj affinitet til NaV med analoge funktionelle virkninger. Et sådant spørgsmål kan kun besvares, hvis der er adgang til en de novo-syntese af toksinet. Derfor blev der foretaget elektrofysiologiske optagelser med ent-BTX-B mod rNaV1.4. Disse data afslørede, at ent-BTX-B er en brugs- og tilstandsafhængig kanalantagonist med en målt halvmaksimal hæmmende koncentration på 5,3 ± 0,6 μM . Koncentrationen for halvmaksimal hæmning af NaV af ent-BTX-B er af samme størrelsesorden som den halvmaksimale effektive koncentration for BTX-B-agonisme (1,0 ± 0,1 μM; fig. S10) målt under identiske betingelser. Især i modsætning til den naturlige antipode forårsagede ent-BTX-B-binding kun en minimal forskydning i V0.5 for aktivering og V0.5 for inaktivering i steady-state (tabel S14). Desuden var kanalblokering fuldt reversibel af denne inhibitor.

For at bestemme, om BTX-B og ent-BTX-B deler et overlappende bindingssted inden for NaV’s indre poreregion, blev ent-BTX-B testet mod fem rNaV1.4 single-point mutanter, som tidligere er blevet vist at destabilisere BTX-binding (Fig. 4, E og F, og fig. S12) (19). Mutation af N434 (46), L1280 (47), F1579 (48) og N1584 (48) til lysin resulterede i et ~3- til 30-foldigt fald i strømblokering ved 5 μM ent-BTX-B. Mod F1236K (49) beholdt ent-BTX-B imidlertid en betydelig aktivitet (33,6 ± 2,1 % strømhæmning). Den tydelige forskel mellem ent-BTX-B og BTX-B indikerer et overlappende, men ikke-identisk bindingsområde inden for den indre pores hulrum. Det ser ud til, at den åbne kanal er tilstrækkelig stor til at rumme lipofile tertiære aminligander (19, 45, 50). Subtile ændringer i bindingen af disse ligander synes at kunne ændre proteinets funktionelle respons dramatisk. Fremtidige undersøgelser vil være rettet mod at afgrænse de præcise kanal-toksin-interaktioner, der adskiller aktivering fra hæmning af BTX-derivater og beslægtede lipofile toksiner.

↵

1. W. A. Catterall

, Activation of the action potential Na+ ionophore by neurotoxins. En allosterisk model. J. Biol. Chem. 252, 8669-8676 (1977). pmid:925017

↵

1. J. Payandeh,
2. T. Scheuer,
3. N. Zheng,
4. W. A. Catterall

, Krystalstrukturen af en spændingsstyret natriumkanal. Nature 475, 353-358 (2011). doi:10.1038/nature10238pmid:21743477

1. J. Payandeh,
2. T. M. Gamal El-Din,
3. T. M. Gamal El-Din,
4. T. Scheuer,
5. N. Zheng,
6. W. A. Catterall

, Krystalstruktur af en spændingsstyret natriumkanal i to potentielt inaktiverede tilstande. Nature 486, 135-139 (2012). pmid:22678296

1. X. Zhang,
2. W. Ren,
3. P. DeCaen,
4. P. Yan,
5. C. Yan,
6. X. Tao,
7. L. Tang,
8. J. Wang,
9. K. Hasegawa,
10. T. Kumasaka,
11. J. He,
12. J. Wang,
13. D. E. Clapham,
14. N. Yan

, Krystalstruktur af en ortolog af NaChBac spændingsstyret natriumkanal. Nature 486, 130-134 (2012).pmid:22678295

↵

1. E. C. McCusker,
2. C. Bagnéris,
3. C. Bagnéris,
4. C. E. Naylor,
5. A. R. Cole,
6. N. D’Avanzo,
7. C. G. Nichols,
8. B. A. Wallace

, Structure of a bacterial voltage-gated sodium channel pore reveals mechanisms of opening and closing. Nat. Commun. 3, 1102-1110 (2012). doi:10.1038/ncomms2077pmid:23033078

↵

1. T. Tokuyama,
2. J. Daly,
3. B. Witkop

, Strukturen af batrachotoxin, et steroidalt alkaloid fra den colombianske pilegiftfrø, Phyllobates aurotaenia, og delvis syntese af batrachotoxin og dets analoger og homologer. J. Am. Chem. Soc. 91, 3931-3938 (1969). doi:10.1021/ja01042a042pmid:5814950

↵

1. T. Tokuyama

, Memorial preface for Dr. John W. Daly: A retrospective on our collaboration on batrachotoxin chemistry. Heterocycles 79, 3-8 (2009). doi:10.3987/COM-08-S(D)Preface-2

↵

1. H. M. Garraffo,
2. T. F. Spande

, Discovery of batrachotoxin: The launch of the frog alkaloid program at NIH. Heterocycles 79, 195-205 (2009). doi:10.3987/REV-08-SR(D)6