II Mikrobiologiske kvalitetsspecifikationer
Gnotobiotiske dyr, uanset om de er axenic (dvs., bakteriefri) eller er forbundet med et defineret mikrobiom bestående af nogle få ikke-patogene bakterier, udgør en lille del af de dyr, der anvendes til forskning; deres anvendelse vil dog sandsynligvis stige i takt med den voksende forskning i mikrobiomets dybe indflydelse og forskellige virkninger på menneskers sundhed og de eksperimentelle reaktioner fra forskningsmodeller (Bech-Nielsen et al., 2012; Friswell et al., 2010; Grada og Weinbrecht, 2013). Som allerede nævnt betegnes de fleste forsøgsdyr som SPF for at angive, at de er blevet vist af HM at være fri for patogener på en udelukkelsesliste.
Udelukkelseslister for gnavere, kaniner og andre almindelige forsøgsdyrsarter er blevet væsentligt harmoniseret i hele den udviklede verden på grund af forsøgsdyrsorganisationernes indsats (Guillen, 2012; Nicklas, 2008; Nicklas et al., 2002) og globaliseringen af biomedicinsk forskning. Desuden tilskynder konkurrencen om kunderne leverandører til at tilbyde SPF-dyr, der er fri for nyopdagede patogener, og diagnostiske laboratorier til at udvikle test for disse patogener (Shek, 2000). Udelukkelseslisterne for SPF-mus og -rotter er mere omfattende end dem for kaniner og andre almindelige forsøgsdyrsarter af en række årsager. For det første, da mus og rotter udgør langt størstedelen af de dyr, der anvendes til forskning, er det rimeligt, at man ved mere om deres indfødte patogener end om andre mindre anvendte forsøgsdyrsarter. Mangfoldigheden af indavlede og naturligt og genetisk manipulerede immundefekte mutante gnaverstammer, der er meget modtagelige for smitsomme sygdomme (Compton et al, 2003; Franklin, 2006) har sammen med følsomme immunoassaymetoder (Smith, 1986b) og fremskridt inden for molekylærgenetik (Compton og Riley, 2001) bidraget til opdagelsen og karakteriseringen af gnaverpatogener (Fox et al., 1994; Ward et al., 1994a), der har vist sig at være årsag til allestedsnærværende, uklare infektioner i laboratorie-gnaver-kolonier (Hsu et al., 2006; Shames et al., 1995). Desuden har den fremherskende brug af forskningsmodeller med gnavere i murinformationsmikroorganismer givet diagnostiske laboratorier og leverandører stærke incitamenter til at udvikle og tilbyde specifikke serologiske og PCR-analyser for virale og andre vanskelige mikrobielle patogener – som ikke kan påvises ved direkte mikroskopisk undersøgelse eller kulturel isolering – kort efter deres opdagelse. Derimod har kommercielle leverandører og diagnoselaboratorier kun haft ringe efterspørgsel fra forsknings- og laboratoriedyrsmedicinsk side efter rutinemæssige serologiske og PCR-tests for kaninvirus, der blev anerkendt for årtier siden, såsom lapine parvovirus (Matsunaga og Matsuno, 1983) (som sekventering for nylig har vist, at det er et bocavirus (personlig meddelelse, K Henderson)), kanin enterisk coronavirus (Deeb et al, 1993; Descoteaux og Lussier, 1990; Descoteaux et al., 1985) og leporid herpesvirus 2 (Matsunaga og Yamazaki, 1976). Endelig er rederivation ved hysterektomi eller embryooverførsel (ET) for at eliminere alle eksogene patogener standardpraksis for SPF-mus og -rotter, men ikke for andre arter.
SPF-eksklusionslister for mus og rotter har inkluderet alle kendte eksogene vira uanset virulens, fordi vira som obligatoriske intracellulære parasitter i sagens natur er invasive; desuden har selv ikke-cytopatiske virusinfektioner vist sig at ændre værtscellers metabolisme (Oldstone et al, 1982). Strengt overholdelse af dogmet om at udelukke alle eksogene vira fra SPF-mus og -rotter er imidlertid blevet upraktisk på mange forskningsinstitutioner, hvor asymptomatiske MNV-infektioner, primært i genetisk manipulerede mus, anses for at være for udbredte til at blive elimineret. Avancerede molekylærgenetiske teknikker har for nylig afdækket et murint astrovirus (Farkas et al., 2012), der muligvis er mere almindeligt hos mus end MNV, og vil helt sikkert finde yderligere udbredte vira, der hidtil er undgået opdagelse, fordi de ligesom MPV, MNV og murint astrovirus er stærkt værtstilpassede og i det store og hele apatogene, selv for immunsvage værter. Som nævnt er listerne over virale udelukkelser for kaniner og andre forsøgsdyrsarter mindre omfattende end for murine gnavere.
Ektoparasitter, helminths, patogene protozoer, bakterier og svampe er en del af udelukkelseslisterne for alle SPF-dyrearter. De patogene bakterier og svampe, der er udelukket for SPF-dyr, adskiller sig hovedsageligt fra kommensale og autochtone (dvs. indfødte) organismer ved deres evne til at krydse anatomiske og biokemiske barrierer for at etablere sig i nicher uden andre mikroorganismer, såsom de nedre luftveje og urogenitale kanaler, indre organer og intracellulært (Casadevall og Pirofski, 2000; Council, 2009; Merrell og Falkow, 2004). Patogenicitet er ikke nødvendigvis en uforanderlig egenskab ved den mikrobielle art, da normalt kommensale mikrober som Escherichia coli er blevet omdannet til patogener gennem erhvervelse af virulensgener, der er overført fra andre bakterier i mobile genetiske elementer som plasmider, phager og transposoner (Dobrindt et al., 2004).
Mikrober klassificeres som primære patogener, hvis de kan forårsage sygdom hos immunkompetente værter. Eksempler omfatter Salmonella, Mycoplasma pulmonis, Helicobacter hepaticus og Clostridium piliforme (ætiologien for Tyzzers sygdom). Opportunistiske patogener som Pseudomonas aeruginosa, β-hæmolytiske streptokokker, Staphylococcus aureus og Pneumocystis-svampe forårsager hovedsagelig sygdom hos immunsvækkede værter, hvad enten de (1) er immunsupprimerede på grund af bestråling eller kemoterapi (Bosma et al., 1983; Cryz et al., 1983; Flynn, 1963; Homberger et al, 1993; Rosen og Berk, 1977; Waggie et al., 1988; Walzer et al., 1989; Weir et al., 1986; Weisbroth et al., 1999) eller (2) iboende immundefekt, såsom athymiske nøgenmus og SCID-mus (severe combined immunodeficient (SCID)) (Bosma et al., 1983; Clifford et al., 1995; Dole et al., 2013b; Henderson et al., 2012; Pantelouris, 1968; Ward et al., 1996). For det meste er det kun primære mikrobielle patogener, der er medtaget på SPF-udelukkelseslisterne for immunkompetente dyr. Opportunister tilføjes, hovedsageligt af kommercielle leverandører, til listerne for immundefekte og genetisk manipulerede mutantlinjer. Da det ikke er usædvanligt, at opportunister som S. aureus forårsager sygdom i standardiserede (dvs. ikke-genmodificerede) immunkompetente stammer af gnavere (Besch-Williford og Franklin, 2007), som ofte anvendes i rederivations- og avlsordninger for genetisk modificerede linjer, er efterspørgslen efter standardiserede, immunkompetente gnaverstammer og bestande, der er fri for opportunistiske såvel som primære patogener, steget. Denne undergruppe af SPF-dyr er blevet omtalt som SOPF for specific opportunistic pathogen-free.
Som opsummering kan man sige, at de infektiøse agenser på SPF-udelukkelseslisterne bestemmes ud fra generelle og institutionsspecifikke kriterier. Generelt er SPF-udelukkelseslisterne for mus og rotter mere omfattende end listerne for mindre populære dyrearter, fordi flere af de indfødte murine virale og værtstilpassede mikrobielle patogener er blevet identificeret og undersøgt; serologiske og PCR-assays stilles til rådighed for murine patogener kort tid efter deres opdagelse; og rederivation for at fjerne alle eksogene patogener fra SPF-mus- og rottepopulationer er standardpraksis. SPF-eksklusionslisterne for alle arter indeholder typisk ektoparasitter, endoparasitter og mikrober klassificeret som primære patogener samt virus; leverandører tilføjer ofte opportunistiske patogener til immundefekte og genetisk manipulerede mutante murinmodeller.
Overholdelse af konsensus-SPF-standarder kan være problematisk på en institution, hvis prævalensen af infektion er høj, eller hvis barrieresystemer og -praksis er utilstrækkelige til at forhindre utilsigtede infektioner i at gentage sig og sprede sig. Mange forskningsintensive akademiske institutioner har besluttet, at fordelene ved at eliminere udbredte infektioner med nyligt anerkendte agenser som MNV og Helicobacter, der sjældent giver sygdom og/eller har været endemiske i deres forskningskolonier i mange år, opvejes af de forstyrrelser for forskningen og omkostningerne ved at gøre det. Eliminering (og udelukkelse) af udbredte patogener og overholdelse af konsensus SPF-standarder reducerer imidlertid risikoen for, at et patogen inficerer yderligere kolonier og forstyrrer forskningen, og forenkler udvekslingen af dyremodeller og samarbejdsundersøgelser med andre forskere og institutioner.