Bioaktivitetstest – Anti-Streptokok-aktivitet
De tre forskellige grønne teer og deres ekstrakter og partikler fremstillet ved 5000 rpm og 10000 rpm og 20000 rpm blev undersøgt for deres antibakterielle egenskaber mod tandpatogenet S.mutans. For at optimere koncentrationen af ekstraktet af grøn te til yderligere forsøg blev seks forskellige koncentrationer (0 μL, 50 μL, 100 μL, 200 μL, 300 μL og 500 μL) af GT-0 (uden fjernelse af partikel) og 5K-S fra GT 1, GT 2 og GT 3 testet mod S. mutans. Figur 2 viser resultaterne af denne undersøgelse. Som det fremgår af fig. 2(a), viste den spektrofotometriske metode, at den antistreptokokale aktivitet for GT-0 og 5K-S i forhold til alle tre grønne teer steg med stigende koncentration. Koncentrationer på 300 μL viste optimal antimikrobiel aktivitet og blev derfor valgt som den optimerede koncentration for alle andre forsøg i denne undersøgelse. Fra nu af blev alle forsøg derfor udført med 300 μL koncentrationer af de grønne tevariabler. Figur 2(b) viser de resultater, der er opnået ved antimikrobiel vurdering ved hjælp af metoden for det samlede antal levedygtige organismer. Resultaterne af pladetællingen korrelerede med de resultater, der blev observeret ved de spektrofotometerbaserede turbiditetsmålinger. En anden interessant observation, der er observeret ud fra disse resultater, er den marginale forbedring af den antimikrobielle aktivitet, der er observeret ved fjernelse af partiklerne ved 5000 rpm (5K-S) sammenlignet med GT-0. Sammenlignet med GT 1-0 viste GT 1-5K-S en øget antibakteriel aktivitet, hvilket også var tilfældet for GT 2 og GT 3. Desuden blev det observeret, at GT 3 udviste den højeste antibakterielle aktivitet og GT 1 den mindste antibakterielle aktivitet.
Optimering af koncentrationseffekten af testvariablerne for antimikrobiel aktivitet ved hjælp af (a) spektralfotometrisk optisk tæthed og (b) Total viable count-metoder.
Da fjernelsen af partiklerne fra den grønne te viste ændringer i bioaktiviteten af grøn te-ekstraktet, blev det foreslået at foretage en detaljeret undersøgelse af studiet af denne effekt. Der blev gennemført en systematisk centrifugeringsproces i tre trin ved 5.000 rpm, 10.000 rpm og 20.000 rpm med henblik på at adskille de største, mindre og endnu mindre partikler fra ekstraktet. Ekstraktet med de store partikler (5K-S), små partikler (10K-S) og fine partikler (20K-S) og partiklerne (5K-P, 10K-P og 20K-P) blev undersøgt for deres interaktion med S. mutans og deres individuelle antibakterielle aktiviteter. Figur 3 viser resultaterne af denne undersøgelse. Som det fremgår af figur 3(a-1,a-2), bekræftede både den turbiditetsbaserede metode og pladetællingsmetoden, at med hensyn til GT 1 resulterede fjernelsen af 5K-P i en øget (marginal forbedring) antibakteriel aktivitet af ekstraktet (5K-S) sammenlignet med GT 1-0. Fjernelse af 10K-P resulterede ikke i nogen yderligere forbedring, og 10K-S blev normalt fundet at være lig med 5K-S-aktiviteten. Fjernelse af 20K-P’er resulterede imidlertid i et tydeligt tab af antimikrobiel aktivitet i 20K-S. Denne observation blev observeret tydeligt for GT 2 (fig. 3(b-1,b-2)) og GT 3 (fig. 3(c-1,c-2)). Selv om tendensen havde varierende grader af variation fra GT 1 til GT 2 til GT 3, er der ingen tvivl om, at fjernelsen af de store partikler af grøn te fra ekstraktet marginalt øgede den antibakterielle egenskab af ekstraktet af grøn te, og at udryddelsen af de mindre partikelfraktioner af grøn te fra ekstraktet førte til et klart fald i den antibakterielle aktivitet af den grønne te, men det er fortsat uomtvisteligt.
Grafisk sammenligning af de antibakterielle aktiviteter af de forskellige testkomponenter i (a) GT 1, (b) GT 2 og (c) GT 3 via (a,b,c -1) spektrofotometrisk metode og (a,b,c -2) Total Viable Count-metoden.
Det er dog vigtigt at understrege her, at hverken 5K-P-, 10K-P- eller 20K-P-partiklerne viste øget stand alone antibakteriel aktivitet, der var højere end ekstrakterne. 5K-P partiklerne viste ingen antibakteriel aktivitet, 10K-P viste et begrænset omfang af antibakteriel aktivitet, mens 20K-P’erne viste en vis aktivitet blandt de to andre modstykker.
Realtidstest af dental bakterie
For at evaluere denne variation i bioaktiviteten af grøn te-ekstrakterne fri af grøn te-partiklerne i realtidssystemer, blev ekstrakterne sat op mod rigtige prøver af dental biofilm fra fem forskellige frivillige mennesker. GT 0, 5K-S og 20K-S af GT 1, GT 2 og GT 3 blev testet. Figur 4 viser det samlede antal levedygtige bakterier efter pladetællingsmetoden, der angiver de bakterier, der overlevede interaktionen med grøn te. Det var interessant at observere, at på trods af prøvens kompleksitet viste 5K-S sammenlignet med GT 0 en øget antibakteriel aktivitet, mens 20K-S viste en nedsat antibakteriel aktivitet i forhold til alle tre grønne teer.
Resultater, der viser den vellykkede dental antibakterielle virkning demonstreret på de reelle prøver, der er opnået fra fem frivillige mennesker.
Fluorescensafbildning af cellerne ved hjælp af acridinorange, hjælper med visualisering og differentiering mellem levende/døde celler efter behandling. Vi afbildede de dentale biofilmprøver fra de fem frivillige før og efter interaktion med GT 0, 5K-S og 20K-S samt kontrol. Figur 5 viser fluorescensresultaterne, der viser effekten af de grønne te-variabler på frivillig 1 (A), frivillig 2 (B), frivillig 3 (C), frivillig 4 (D) og frivillig 5 (E). Som det fremgår af figur 5(a), viser kontrolbillederne i A, B, C, D og E overvejende orange fluorescens, hvilket indikerer tilstedeværelsen af aktivt metaboliserende levende dentalbakterier. Som det fremgår af billedet, har den afmonterede biofilm fra tænderne bevaret sin biofilmidentitet og fremstår som mikrobielle måtter i kontrolbillederne. GT 0-behandlingen resulterede i den forventede dræbende virkning af grøn te (fig. 5(b)) for alle de frivillige forsøgspersoners vedkommende. De grønne fluorescerende områder (døde celler) var fremherskende, med områder med orange fluorescens midt imellem. Panel (c) viser resultaterne fra 5K-S-supernatanten fra GT 3, hvor de største partikler af grøn te blev fjernet fra ekstraktet. Som det fremgår af de fluorescensmikroskopiske billeder, blev der ikke observeret nogen orange fluorescens og fuldstændig grøn fluorescens, hvilket indikerer en total tilintetgørelse af tandbakterierne/biofilmen. Det var også interessant at observere, at der ikke længere blev observeret biofilmpletter eller -måtter, biofilmmåtterne blev opløst, og det eneste, der ses, er spredte celleklumper i alle testprøver (A(c), B(c).C(c).D(c) og E(c)). Endelig viser fig. 5(d) resultaterne af 20K-S-interaktionen, og der ses et betydeligt fald i den dræbende effekt af grøn te-ekstraktet. Forekomsten af de orange fluorescerende levende bakterieceller indikerer et fald i ekstraktets antimikrobielle aktivitet ved fjernelse af nanokomponenterne fra grøn te. Selv om der også observeres grønne fluorescerende døde celler, synes forholdet mellem de levende/døde celler at være ændret. Disse resultater bekræfter den tendens, der er rapporteret via den spektrofotometriske metode og pladetællingsmetoden for antimikrobiel aktivitet af de forskellige testkomponenter af grøn te.
Epifluorescensmikroskopisk billede af den levende/døde karakter af den orale biofilm fra (A) frivillig 1 (B) frivillig 2 (C) frivillig 3 (D) frivillig 4 i (a) kontrol (ingen GT-komponent) (b) GT 0 (c) 5K-.S (d) 20K-S tilhørende GT 3.
FE-SEM-observation af kontrol- og 5K-S-interagerede tandbakterier er vist i fig. 6 (a-c). Som det fremgår af figuren, viser kontrollen (fig. 6(a)) en veludviklet biofilm (frivillig 4), mens GT 0 (fig. 6(b)) af GT 3 og 5K-S (fig. 6(c)) interaktion resulterede i beskadigelse af cellerne og biofilmen, som det fremgår af celleaffaldet. Billeder optaget ved hjælp af CLSM (d) viser, at langt størstedelen af tandbakterierne fra alle fem frivillige blev dræbt af GT 3 (5K-S). GT 3-GT 0 og 5K-S viste sig at være de mest lovende mod tandbakterierne fra alle frivillige.
FE-SEM-billeder af tandprøve fra V4 (a) kontrol (ubehandlet) (b,c) GT 3-behandlet, der viser omfattende skader efter inkubation med grøn te. (d) viser CLSM-billederne af cellerne, idet de fluorescerende celler repræsenterer de døde celler hos de fem forskellige frivillige efter behandling med GT 3 20K-P’er.
Karakterisering af ekstrakt og partikler
Med resultaterne fra bioaktivitetstesten baseret på den antibakterielle aktivitet af komponenterne i grøn te, der viser, at tilstedeværelsen og fraværet af partikler fra grøn te faktisk ændrer ekstraktens aktivitet, er det nødvendigt, at ekstrakterne GT 0, 5K-S, 10K-S og 20K-S og derefter partiklerne 5K-P, 10K-P og 20K-P fra de tre grønne teer karakteriseres udførligt.
Biokemisk karakterisering
Antibakteriel aktivitet er generelt styret af et ekstrakts samlede phenolstoffer, flavanoider og antioxidantevne. Alle disse parametre blev undersøgt og sammenlignet blandt de ekstrakter og partikler, der blev anvendt i denne undersøgelse. Figur 7(a) viser de opnåede resultater for GT 1. Hvad angår flavanoider, blev der, som det fremgår af grafen, ikke observeret nogen stor forskel i flavanoidindholdet blandt GT 0, 5K-S, 10K-S og 20K-S ekstrakterne, GT 0 viste en marginal stigning i forhold til resten. For partiklerne af grøn te havde 5K-P imidlertid det højeste indhold af flavanoider, mens 10K-P og 20K-P fulgte efter med et flavanoidindhold, der svarede til det, der blev fundet i ekstrakterne. For GT 2 fig. 7(b) og GT 3 fig. 7(c) var flavanoidindholdet anderledes, idet 5K-S- og 10K-S-ekstrakterne viste det højeste flavanoidindhold sammenlignet med GT 0. 5K-P- og 10K-P-partiklerne viste et meget lavt flavanoidindhold. Undtagelserne var, at 20K-S-ekstrakterne viste færre flavanoider sammenlignet med de andre ekstrakter, og 20K-P-partiklerne viste højere flavanoider sammenlignet med de andre partikler.
Sammenligning af de biokemiske aktiviteter af (a) GT 1 (b) GT 2 og (c) GT 3-komponenterne baseret på deres antioxidante aktivitet (ved hjælp af DPPH), indhold af flavonoider (AlCl3-metoden) og samlede phenolstoffer (Folins metode).
Med hensyn til de samlede phenolstoffer blev der i GT 1 fundet den højeste værdi i GT 0, mens resten viste mindre værdier. I GT 2 og GT 3 blev det imidlertid igen observeret, at der blev observeret en lignende tendens med hensyn til phenolindholdet, hvor alle ekstrakterne viste næsten ens phenolindhold. Men 5K-P og 10K-P viste mindst phenolindhold sammenlignet med 20K-P.
Med hensyn til antioxidantaktivitet viste GT 1-ekstrakterne (GT 0, 5K-S, 10K-S og 20K-S) meget høj antioxidantaktivitet, mens 5K-P og 10K-P viste seks gange lavere antioxidantaktivitet. Det skal dog nævnes her, at 20K-P’erne viste signifikant højere antioxidant aktivitet sammenlignet med 5K-P og 10K-P. I GT 2 og GT 3 var denne tendens mere udtalt, idet 5K-S og 10K-S udviste højere antioxidantaktivitet sammenlignet med GT 0. Men der blev observeret et tydeligt fald i antioxidantaktiviteten for 20K-S med en tilsvarende stigning i aktiviteten i 20K-P’erne i GT 2 og GT 3. Det skal bemærkes, at blandt de tre undersøgte grønne teer havde GT 3 de højeste værdier af disse bioaktive forbindelser, tæt fulgt af GT 2, og til sidst var GT 1 væsentligt bagefter. Denne tendens korrelerer stærkt med de grønne teers antimikrobielle bioaktivitet, som var i rækkefølgen GT 3 > GT 2 > GT1.
FE-SEM-analyse
Den 5K-P, 10K-P og 20K-P partiklerne blev afbildet ved hjælp af FE-SEM for deres morfologiske detaljer og størrelser. Figur 8 viser morfologien af 5K-P (a), 10K-P (b) og 20K-P (c) af partiklerne fra GT 1 (A), GT 2(B) og GT 3 (C). Der blev observeret uregelmæssige morfologier uden tydelig form i de fleste tilfælde. Som det fremgår af fig. 8, blev 5K-P-partiklerne i GT 1 og GT 2 observeret som makropartikler, og det er disse partikler, som vi ser synligt i vores kop grøn te. Tabel 1 viser deres størrelser, GT 2 (B) 5K-P-partikler var de største (50-80 μm), efterfulgt af GT 1 (B(a)), som var i størrelsesområdet 15-25 μm. GT 3 5K-P-partikler var relativt mindre i størrelsesområdet 6-30 μm (fig. 8(C(a))). Som det fremgår af mikrograferne, havde partiklerne ikke faste størrelser, hvilket kan forventes af sådanne rå ikke-standardiserede kommercielle prøver. 10K-P-partiklerne havde en mikrostørrelse på 4-10 μm for GT 1 (A(b)), GT 2 havde en størrelse på 2-10 μm (fig. 8B(b)) og GT 3 lå i størrelsesområdet 0,5-3 μm (C(b)). 20K-P-partiklerne var mindre mikro- til nanostørrelse, med GT 1-partikler i størrelsesområdet 0,5-6 μm (A(c)), GT 2-partikler (B(c)) var 200 nm til 540 nm og GT 3-partikler (C(c)) var de mindst store, der fandtes i størrelsesområdet 50 nm-300 nm. Som det fremgår af disse resultater, blev det således observeret, at 20K-P-partikler, der besad forbedrede bioaktive komponenter og viste antioxidant- og antibakterielle egenskaber, fandtes i nær-nanoregimet.
FE-SEM-mikrografer af (a) 5K-P, (b) 10K-P og (c) 20K-P af GT 1 (A), GT 2 (B) og GT 3 (C), der viser morfologi og størrelse af de ekstraherede partikler. Indsatserne viser optiske mikrobilleder af de tilsvarende partikler.
UV-Vis-spektrofotometri
Figur 9 viser UV-Vis-spektret af ekstrakterne og partiklerne, der er karakteriseret for deres EGCG-indhold. Atomssa & Gotlap 201539 har rapporteret absorbansen for catechin-familien: EGCG viser en absorbans i intervallet 248-361 nm i vand med λmax ved 273,6 nm; ECG 246- 363 nm λmax ved 276,8 nm; spektralområdet for EGC i vand er 254-378 nm og λmax ved 269,6 nm og for EC er 252-328 nm med λmax ved 278,4 nm. Som det fremgår af fig. 9(a) GT-1, ses kun absorptionstoppen af EGCG ved 273 nm. Med hensyn til EGCG-toppen blev der ikke observeret nogen forskel inden for ekstrakterne (GT 0, 5K-S, 10K-S og 20K-S). For så vidt angår partiklerne af grøn te blev det imidlertid observeret, at 20K-P-partiklerne viste en betydelig stigning i EGCG-intensiteten sammenlignet med 5K-P og 10K-P’erne. Det var interessant at observere, at 20K-P’erne indeholdt næsten 50 % EGCG i ekstrakterne.
UV- Synlige spekter af de forskellige komponenter af grøn te, der blev anvendt som testvariabler i denne undersøgelse.
For GT 2 blev det observeret, at ekstrakterne viste tilstedeværelsen af andre toppe fra catechinfamilien i området 248-363 nm, som det fremgår af de forskellige toppetoppe i dette område i figur 9(b). Fjernelse af partiklerne fra ekstraktet førte til forskydninger i toppene. Især ekstrakterne viste tydelige forskydninger. For partiklerne 5K-P og 10K-P blev det imidlertid observeret, at de udelukkende viste EGCG-toppe og med lav intensitet. Der lægges her vægt på 20K-P-partiklerne, som viste catechintoppe af næsten samme intensitet som ekstrakterne. Det blev observeret, at i modsætning til 5K-P- og 10K-P-partiklerne viste 20K-P-partiklerne ikke kun EGCG-toppe, men også de andre toppe fra katekinfamilien, som var ret ens med ekstrakterne.
GT 3 (fig. 9(c)), gav ekstrakterne forskellige toppe, herunder katekintoppene. Men sammenlignet med GT 1 og GT 2 viste 5K-P- og 10K-P-partiklerne selv EGCG-toppe med høj intensitet. Tendensen, at 5K-P- og 10K-P-partiklerne kun viste EGCG-toppe, fortsatte også i GT 3. 5K-P viste højere EGCG end GT-1- og GT 2-partiklerne, men sammenlignet med 10K-P-partiklerne i GT 3 var den meget lavere. 10K-P af GT 3 viste et EGCG-indhold svarende til det i ekstrakterne. 20K-P’erne registrerede i dette tilfælde de højeste catechin-toppe og overgik også ekstrakterne. Der blev observeret pæleforskydninger svarende til dem, der blev rapporteret inden for vand- og opløsningsmiddelekstraktion for 20K-P’erne i forhold til ekstrakterne. Det var interessant at bemærke, at 20K-P-toppene var smallere og af høj intensitet. Der blev observeret en usædvanlig høj top ved 269 nm svarende til EGC i 20K-P’erne. Med den generelle observation, at 20K-P’erne indeholdt betydeligt store mængder catechiner i GT-1, GT 2 og GT 3 blev bekræftet via disse undersøgelser.
FT-IR
Det FT-IR-spektrum, der er opnået fra partiklerne 5K-P, 10K-P og 20K-P af GT 3, som viste den maksimale antibakterielle aktivitet og unikke egenskaber, er præsenteret i fig. 10(a). Spektrene stemmer overens med det karakteristiske bånd for EGCG. Ponnuraj et al, 201540 rapporterer EGCG-fingeraftryk ved 3357,46 cm-1 for O-H-gruppen knyttet til den aromatiske ring, 1691,27 cm-1 og 1616,06 cm-1 stærkt for C = O-gruppen, der forbinder trihydroxybenzoatgruppen og chromangruppen, 1447,31 cm-1 for C-H-gruppen, der er til stede i chromangringen, 1348.00 cm-1, 1222,65 cm-1 for O-C = O-gruppen, 1148,40 cm-1 for O-H-gruppen, 1041,37 cm-1 for C-O-C-gruppen, der forbinder chromanringen og trihydroxybenzoatringen, og 825,38 cm-1 for C-H-gruppen i den aromatiske ring. Det var interessant og støttende at observere, at der blev observeret et tydeligt mønster som en funktion af stigende centrifugering, hvilket svarer til faldende partikelstørrelser. Ved 5K-P var EGCG-båndene lavest i intensitet, efterfulgt af 10K-P og 20K-P, der viste bånd med høj intensitet. Dette korrelerer også med de resultater, der blev observeret i UV-undersøgelserne.
FT-IR-resultater af 5K-P-, 10K-P- og 20K-P-partiklerne isoleret fra (a) GT 3; (b) 5K-P og 20K-P fra GT 1 og (c) 20K-P-nanopartiklerne isoleret fra GT-1, GT 2 og GT 3.
Figur 10(b) viser FT-IR-spektre opnået fra GT 1 5K-P og 20K-P, I tilfælde af GT 1 var der ikke meget forskel i EGCG-båndene mellem de to partikler. Disse resultater stemmer overens med de resultater, der også blev observeret i forbindelse med de UV-spektrofotometriske undersøgelser. Figur 10(c) viser de sammenlignende spektrer for 20K-P’erne fra GT 1, GT 2 og GT 3. Gradientmønsteret med øgede EGCG-bånd i rækkefølgen GT 1 < GT 2 < GT 3 er tydeligt.