Non-organoid Approaches
Til dato har tarmepitelcellelinjer været de vigtigste in vitro-modelsystemer til at vurdere tarmens transportprocesser, mens enteroendokrine cellelinjer er almindelige modeller til at studere sekretionen af forskellige tarmhormoner. En etableret model for småtarmens enterocytter er CaCo-2-cellinjen (eller CaCo-2 TC7-subklonen), der stammer fra et adenocarcinom i tyktarmen. Denne cellelinje dyrkes almindeligvis på transwell-plader i op til 3 eller 4 uger efter influenza til undersøgelser af intestinal transport af næringsstoffer, lægemidler eller andre forbindelser ved hjælp af radiomærkede eller fluorescensmærkede substrater (Farrell et al., 2013; Ganapathy et al., 1995; Wang og Li, 2017). HT-29-cellerne (og subkloner) er en human kolonkarcinomcellelinje, der er veletableret til forskning i tarmtransportører, især sukkertransportører (Delezay et al., 1995; Liu et al., 2016). For at studere transportørernes rolle i intestinal næringsstofsansning er der imidlertid behov for andre cellelinjer. De mest fremtrædende enteroendokrine cellelinjer, der anvendes til undersøgelser af tarmhormonsekretion, er den murine GLUTag-cellelinje (Emery et al., 2015), den murine STC-1-cellelinje (Jiang et al., 2016) og den humane NCI-H716-cellelinje (Pais et al., 2014). Ingen af dem afspejler imidlertid den komplekse biologi af enteroendokrine celler in vivo (Kuhre et al., 2016). Enteroendokrine celler er fordelt i hele tynd- og tyktarmen, og deres ekspressionsmønstre af forskellige tarmhormoner er meget forskellige, afhængigt af deres placering i tarmkanalen (Habib et al., 2012). For eksempel stiger antallet af GLP-1-secernende celler (ofte kaldet L-celler) gradvist fra proximal til distal tarm, mens antallet af GIP-secernende celler (kaldet K-celler) falder. Enteroendokrine cellelinjer, som alle er tumorafledte, udgør således meget enkle og kunstige modelsystemer til undersøgelse af næringsstofsansøgning, tarmhormonsekretion og de underliggende molekylære og regulerende mekanismer. Fordelen ved pattedyrcellelinjer er, at de er veletablerede i mange laboratorier rundt om i verden. Der er mange videnskabelige data til rådighed, og der findes etablerede forsøgsprotokoller. Desuden er de lette at håndtere, og dyrkningen er billig. Alligevel er alle disse cellelinjer meget enkle og kunstige modelsystemer. De stammer for det meste fra tumorer, og de repræsenterer kun en enkelt celletype, hvilket ikke afspejler kompleksiteten af tarmslimhinden, som består af flere specialiserede celletyper. Desuden er de normalt dyrket i to dimensioner, hvilket ikke afspejler den indfødte tarms tredimensionelle arkitektur.
I særdeleshed til undersøgelser af næringsstofsansning og tarmhormonsekretion er primær intestinal cellekultur en langt bedre tilgang, og den er blevet etableret som en pålidelig model i de seneste år (Reimann et al., 2008). Primærkulturer dyrket fra isolerede tarmkrypter har den fordel, at de kan genereres fra forskellige tarmsegmenter (Parker et al., 2012) og fra mus (vildtype- eller knockout-dyr) (Diakogiannaki et al., 2013) eller mennesker (Habib et al., 2013). De omfatter absorptive enterocytter samt forskellige undertyper af enteroendokrine celler, som findes i den indfødte tarm. Disse kulturer indeholder imidlertid dårligt differentierede enterocytter og er derfor ikke egnede til påvisning af intestinale transportører og receptorer på protein- eller funktionsniveau. De er et kortsigtet dyrkningssystem, der ikke er egnet til langtidsforsøg, og de kan ikke passageres, hvilket øger antallet af forsøgsdyr, der er nødvendige for at forberede kulturen. Det samme er tilfældet med isolerede tarmepitelceller (Grossmann et al., 1998), som omfatter alle slimhindecelletyper, men som udviser meget begrænset levedygtighed in vitro og ikke repræsenterer et intakt epitel.
Korttidsstabilitet er også en begrænsning for vævseksplorater, som f.eks. everted tarmringe (Roder et al., 2014) eller tarmsække fra musetarm eller rottetarm (Praslickova et al., 2012; Surampalli et al., 2016), som ofte anvendes til transportundersøgelser. Everted tarmringe kan enten inkuberes med mærkede substrater in vitro eller kan fremstilles efter oral indgivelse af f.eks. radiomærkede transportørsubstrater i gnavere (Roder et al., 2014). Everted tarmsække kan endda bruges til fluxundersøgelser, da de luminale og basolaterale kompartmenter kan målrettes separat. Forberedelse og håndtering er dog ikke triviel og kræver en vis erfaring. Fordelen ved vævseksplorater er, at de kan fremstilles fra forskellige tarmsegmenter, og at deres regionsspecifikke in vivo karakteristika bevares in vitro. Tarmeksplantatet bevarer sin oprindelige arkitektur, og slimhinden er forbundet med det omgivende væv, f.eks. submucosa eller muskler, og neuroner, lymfe og blodkar er inkluderet. Afhængigt af det videnskabelige spørgsmål kan dette være en fordel eller en ulempe. Intestinal aftastning af næringsstoffer og efterfølgende tarmhormonsekretion undersøges undertiden i perfunderet gnavertarm (Kuhre et al., 2015). Dyret er bedøvet, og tarmlumen perfunderes med de formodede stimulanser ex vivo. Den basolaterale væske opsamles, og tarmhormonindholdet analyseres. Denne teknik er ikke teknisk let, og etiske forhindringer begrænser den brede anvendelse af denne metode til undersøgelser af næringsstofinduceret tarmhormonfrigivelse.
En pålidelig og veletableret model, der anvendes til undersøgelser af funktionelle egenskaber og regulering af tarmtransportører, er heterolog ekspression i Xenopus laevis oocytter (Hirsch et al., 1996). Efter mRNA-injektion udtrykkes proteinet af interesse i oocytten, og transportkinetik kan undersøges ved hjælp af radiomærkede substrater eller elektrofysiologiske tilgange i tilfælde af elektrogeniske transportører (Schulze et al., 2014; Stelzl et al., 2016). Denne teknik er et fremragende værktøj til at studere funktionelle egenskaber ved en bestemt transportør, selv om målproteinet befinder sig i et kunstigt miljø, og der er ingen reguleringsfaktorer til stede, som de ville være i pattedyrcellen. Desuden er tilgængeligheden af intakte oocytter og den komplicerede håndtering, herunder injektion af oocytter, kritiske spørgsmål, der skal tages i betragtning, når denne teknik anvendes. Meget nemmere heterologe ekspressionssystemer er gær og E. coli. De gør det muligt at generere rekombinante mutanter, som, når de først er genereret, kan dyrkes eller fermenteres i større målestok og levere store mængder protein. Selv om disse mikroorganismer er billige og nemme at håndtere, er de meget forenklede modelsystemer til undersøgelse af pattedyrproteiner og især store membranproteiner. Problemer, der ofte opstår, er fejlfoldning af proteinet eller mislykket membranindsættelse. Derfor er disse systemer snarere nyttige til strukturel karakterisering af rensede proteiner eller proteindomæner (Beale et al., 2015) end til detaljerede undersøgelser af pattedyrs transportørers funktion og regulering.
Nye og lovende tilgange, der er blevet etableret i den allerseneste tid, er tredimensionelle modeller af pattedyrs cellekulturer. Tarmcellelinjer som CaCo-2 eller HT-29 dyrkes på stilladser, hvilket skaber en mere tarmlignende arkitektur, som fører til forbedret differentiering (Chen et al., 2015). Andre tredimensionelle modeller dyrkes direkte fra humane små-tarm epithelceller og myofibroblaster på belagte mikroporøse membraner (Maschmeyer et al., 2015a; Maschmeyer et al., 2015b) og kan ikke formeres in vitro. Disse modeller har potentiale til at blive etableret til transportstudier af næringsstoffer eller lægemidler, og kulturer dyrket fra humane tarmepithelceller omfatter endda forskellige slimhindecelletyper, men ikke enteroendokrine celler. Det samme gælder for tredimensionale bioprintede væv, en anden teknologi, der er opstået for ganske nylig og har vundet enorm opmærksomhed. Denne tilgang er af større værdi for regenerativ medicin og transplantation end for eksperimentel forskning (Murphy og Atala, 2014). Bioprinting af forskellige væv, herunder hjerte, hud og knogler, er blevet etableret med succes, men bioprintede tarmvæv er indtil videre sjældne og skal forbedres yderligere (Wengerter et al., 2016).