I vores undersøgelse, vi retrospektivt påviste tilstedeværelsen af CALR-mutationer i en kohorte af 524 JAK2 V617F-negative patienter, der præsenterede sig med klinisk og/eller laboratoriemæssig mistanke om MPN med det primære mål at bestemme den diagnostiske værdi af denne påvisning. I den observerede periode var CALR-mutationer ikke blevet rutinemæssigt undersøgt hos patienter med mistanke om MPN i vores center, da de først for nylig er blevet opdaget1,2. I modsætning hertil er JAK2 V617F-mutationen allerede blevet analyseret rutinemæssigt, siden den blev opdaget i 200520. Derfor blev JAK2 V617F-positive patienter udelukket fra undersøgelsen. En MPL-mutation er et relativt sjældent fund hos MPN-patienter og er for det meste til stede hos patienter med enten ET eller PMF21. I vores laboratorium blev MPL-testning først for nylig inkluderet i den diagnostiske algoritme hos patienter med mistanke om MPN og udføres først efter udelukkelse af JAK2 V617F- og CALR-mutationer. Derfor blev MPL-status ikke defineret hos alle vores patienter på tidspunktet for den første undersøgelse.
Vores center er et universitetsmedicinsk hospital, der betjener et område med ca. 1.000.000 indbyggere og er et henvisningscenter for hæmatologiske maligniteter. Alle patienter, der blev henvist til hæmatologisk afdeling, blev først vurderet af praktiserende læger uden detaljeret viden inden for hæmatologiske maligniteter. Som det fremgår af tabel 3, var det kun en del af de patienter, der blev henvist til hæmatologisk afdeling, der havde patologiske kliniske og/eller laboratorieparametre, der var mistænkelige for MPN på tidspunktet for den første undersøgelse. Derfor var de fleste patienter, der blev henvist til hæmatologisk afdeling, personer uden en hæmatologisk malignitet, da vi konstaterede, at 380 patienter (380/524 = 72,5 %) var MPN-fri. Disse patienter blev diagnosticeret med sekundære ændringer i det perifere blodindhold forårsaget af forskellige forhold som f.eks. jernmangel, infektiøse og inflammatoriske sygdomme, hyposplenisme, malignitet, rygning, nylig operation, brug af kortikosteroider og kronisk hypoxi. Følgelig var antallet af CALR-positive patienter i vores kohorte lavt. Vi identificerede 4,4 % af de patienter, der var mistænkt for MPN, som CALR-positive, hvoraf de fleste blev diagnosticeret med enten ET eller PMF. De fleste lignende undersøgelser analyserede antallet af CALR-positive patienter med bekræftet MPN; derfor var antallet af CALR-positive patienter meget højere, fra 12 til mere end 20 %22,23,24,25,26. På baggrund af vores data ville det være gavnligt at forbedre den diagnostiske tilgang til patienter med forhøjede niveauer af en eller flere blodcellelinjer, da dette i de fleste tilfælde ikke skyldes hæmatologisk malignitet. Patienterne bør rutinemæssigt screenes for de mest almindelige årsager til sekundær erytrocytose, trombocytose og leukocytose, og blodtallet bør gentages mindst én gang ved opfølgningsbesøg, inden de henvises til hæmatologisk afdeling. Molekylær genetisk testning bør forbeholdes patienter med stor mistanke om klonal hæmatologisk sygdom og bør ikke udføres hos alle patienter, der henvises til hæmatologisk afdeling.
CALR-mutationer er almindeligt identificeret hos JAK2 V617F-negative patienter med ET1,2. I vores center blev kun et mindretal af CALR-positive patienter (7/23 = 30 %) diagnosticeret med ET i henhold til WHO-kriterierne fra 2008 på tidspunktet for den første undersøgelse. Hovedårsagen hertil var den relative reservation over for knoglemarvsundersøgelse hos patienter med moderat trombocytose og en lav risiko for trombotiske komplikationer. Dette betyder imidlertid, at vi kan have undervurderet antallet af patienter med klonal trombocytose. Ved at bekræfte tilstedeværelsen af CALR-mutationer var vi i stand til retrospektivt at diagnosticere 9 patienter med ET i henhold til de modificerede WHO-kriterier for ET13. Selv om alle disse patienter blev fulgt op på vores afdeling på grund af høj mistanke om klonal trombocytose, er det af stor prognostisk og terapeutisk fordel at kunne bekræfte diagnosen ET ved en ikke-invasiv procedure som molekylærgenetisk testning. CALR-mutationer er derfor vigtige diagnostiske kendetegn for ET, hvilket også er blevet bekræftet for nylig i litteraturen27,28.
Alle patienter med PMF blev diagnosticeret i henhold til WHO-kriterierne på tidspunktet for undersøgelsen på hæmatologisk afdeling. Identifikation af CALR-mutationer bekræftede retrospektivt diagnosen, men havde ingen direkte diagnostisk eller terapeutisk betydning.
CMML er en subtype af MDSs/MPNs og ikke strengt MPNs12. CALR-mutationer hos patienter med CMML er ekstremt sjældne og spiller ikke en vigtig rolle i dens patogenese. En gruppeundersøgelse af Zamora et al. viste, at kun 1 ud af 174 patienter med CMML havde en CALR-mutation29. Patienten i vores undersøgelse, der blev diagnosticeret med CMML type 1 og senere udviklede sig til myelofibrose, kan være blevet fejldiagnosticeret på tidspunktet for den første undersøgelse, da PMF og CMML har mange fælles træk, herunder monocytose og knoglemarvsfibrose. I en nyere undersøgelse af Hu et al. gjorde en mere præcis analyse det muligt at omklassificere mange patienter, der var diagnosticeret med CMML, til at have PMF, hvilket viser, at der bør foretages en mere dybtgående analyse for at stille en præcis diagnose, især hos patienter med molekylære biomarkører, der er typiske for ET/PMF11,30.
Mere end 50 frameshift CALR-mutationer er blevet beskrevet, og de er alle placeret i exon 9 af CALR-genet. Der findes to hovedtyper af CALR-mutationer: type 1 (en 52-bp-deletion; p.L367fs*46) og type 2 (en 5-bp TTGTC-indsættelse; p.K385fs*47). På grundlag af deres molekylære karakteristika kan andre mutationer grupperes som type 1-lignende og type 2-lignende31. I vores undersøgelse var den mest almindelige type CALR-mutation type 1, hvilket er i overensstemmelse med data fra litteraturen2,16,32. Mutationer, der hverken er type 1 eller type 2, bør underklassificeres som type 1-lignende eller type 2-lignende, da dette kan have en indvirkning på den kliniske fænotype og, i tilfælde af PMF, endda på overlevelsen17. Type 1-lignende og type 2-lignende mutationer i vores undersøgelse blev defineret ved hjælp af AGADIR15, en statistisk tilnærmelsesalgoritme, der beregner helix-propensity for de 31 unikke aminosyresekvenser, der ændres af CALR-mutationer16. Denne algoritme er blevet anvendt i lignende undersøgelser og udgør et vigtigt redskab i CALR-mutationssubklassificering16,17. Det synes yderst vigtigt at definere typen af CALR-mutation korrekt, da dette også har en diagnostisk betydning. Det er kendt, at kun mutationer, der fører til et + 1 (-1 + 2) frameshift af læserammen, er patogene6. Andre CALR-mutationer kan være germlinevarianter af CALR med ukendt klinisk betydning. I vores undersøgelse blev der påvist ikke-frameshift CALR-mutationer hos to patienter. Den ene af disse patienter blev diagnosticeret med reaktiv trombocytose på tidspunktet for undersøgelsen på hæmatologisk afdeling og blev retrospektivt defineret som CALR-positiv. En detaljeret analyse bekræftede en missense CALR-mutation, der resulterer i udskiftning af glutaminsyre med asparaginsyre ved aminosyreposition 398. Den samme mutation blev opdaget hos en patient med WHO-defineret kronisk neutrofil leukæmi (CNL) i en undersøgelse af Lasho et al. Hans undersøgelse konkluderede, at CALR-mutationer, der ikke resulterer i dannelse af en særskilt C-terminus, tyder på en anden patogen mekanisme, som måske endnu ikke er kendt33. I vores undersøgelse antog vi, at vores patient ikke udviklede en CALR-mutation, som ville indebære en klonal hæmatologisk sygdom. I henhold til patientens anamnese, kliniske undersøgelse og laboratoriefundene var det mest tyder på reaktiv trombocytose. På tidspunktet for skrivelsen af denne artikel var patienten ved godt helbred uden mulige komplikationer i forbindelse med klonal hæmatologisk sygdom.
En anden patient med en ikke-frameshift CALR-mutation blev diagnosticeret med MPN-U. Denne patient bar en germline in-frame-deletion i CALR-genet (NM_004343.3 (CALR):c.1142_1144delAGG; p.(Glu381del)), som allerede var blevet genkendt hos en symptomatisk patient med MPN34. Selv om KDEL-motivet blev bevaret, førte deletionen af en aminosyre (p.(Glu381del)) til en ændring af proteinets sekundærstruktur samt den tredimensionelle struktur, hvilket førte til konklusionen om den patogene karakter af denne in-frame-deletion23,34,35. Vores patient med MPN-U blev desværre tabt til opfølgning, og en præcis hæmatologisk diagnose eller eventuelle komplikationer kunne ikke defineres. Laboratoriefundene tydede dog på en klonal hæmatologisk sygdom.
I vores undersøgelse opdagede vi fire nye CALR-mutationer i exon 9, som, så vidt vi ved, endnu ikke er registreret i COSMIC- (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) eller HGMD-databasen (http://www.hgmd.cf.ac.uk). COSMIC-databasen er verdens største ekspertkuraterede database over somatiske mutationer i kræft hos mennesker. Den beskriver over 4 millioner kodningsmutationer36. HGMD-databasen er et forsøg på at samle alle kendte (offentliggjorte) genlæsioner, der er ansvarlige for arvelige sygdomme hos mennesker19. De nye mutationer, der blev defineret i vores undersøgelse, er NM_004343.3 (CALR):c.1127_1145del19, p.(Arg376Glnfs*48), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsGTTGTC, p.(Lys385Serfs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsTTTATC, p.(Lys385Ilefs*47), og NM_004343.3 (CALR):c.1132_1153del22, p.(Glu378Argfs*45). Alle disse mutationer var type 2-lignende mutationer.
ET og PMF er forbundet med en øget risiko for trombotiske og tromboemboliske hændelser, som udgør vigtige årsager til morbiditet og dødelighed37. Reduktion af risikoen for trombotiske og tromboemboliske komplikationer er et af de vigtigste mål med behandlingen, især hos patienter med ET38. Disse patienter har også en højere risiko for blødningskomplikationer, som kan være relateret til behandlingskomplikationer eller erhvervet von Willebrands syndrom (AVWS) på grund af ekstrem trombocytose (trombocytter > 1000 × 109/L)28,39,40. Risikoen for trombose hos patienter med ET er over 20 %41. I en svensk undersøgelse udviklede 35 % af patienterne med ET vaskulære komplikationer42. Ved PMF er trombotiske hændelser omtrent lige så hyppige som ved ET43. Prævalensen for trombotiske komplikationer hos patienter med PMF varierer fra 7 til 30 %44,45,46. I vores undersøgelse var prævalensen af trombotiske komplikationer hos CALR-positive patienter 30 %. Tre patienter havde imidlertid udviklet en trombotisk komplikation mere end 10 år før mistanken om MPN-diagnosen. Den reelle prævalens af trombotiske komplikationer i vores undersøgelse var derfor lavere. En patient udviklede vitreusblødning, som var et resultat af utilstrækkelig antikoagulationsbehandling med warfarin. Ingen af de to patienter med en blødningskomplikation havde ekstrem trombocytose på tidspunktet for komplikationen. Sammenlignet med JAK2 V617F- og MPL-mutationer er CALR en gunstig mutation og er forbundet med en lavere forekomst af trombotiske hændelser1,2,47. De fleste CALR-positive patienter, der udviklede trombohæmorrhagiske komplikationer, blev diagnosticeret med type 1-mutationer (71,4 %). Som allerede vist havde patienter med type 1-lignende mutationer en højere risiko for trombose sammenlignet med patienter med type 2-lignende mutationer10.
CALR-mutationer vides i øjeblikket at være en af de tre vigtigste mutationstyper, ud over JAK2 V617F og MPL-mutationen, hos patienter med ET eller PMF. Der var dog stadig 10-15 % af patienterne med ET eller PMF med en ukendt molekylær genetisk markør, der ligger til grund for sygdommen. Disse patienter betegnes som “triple negative “48. Hos disse patienter er der blevet søgt efter nye molekylære biomarkører ved at sekventere kodende exoner i myeloid cancergener, hvilket har givet lovende resultater. Dette kan give en personlig tilgang til diagnosticering af patienter med MPN49.
CALR-mutationer hos MPN-patienter undersøges også med henblik på deres terapeutiske potentiale50,51,52. CALR exon 9-mutationer kunne være mål for kræftens immunterapi, da de har vist sig at fungere som immunogene neo-antigener51. Ved behandling af MPN kunne det være gavnligt at kombinere CALR-vacciner med immunmodulerende behandlinger53 såsom interferon-alfa (IFN-α)54 eller programmeret død 1-ligand (PD-L1)55 som en kombinatorisk kræftvaccination53. CALR-mutationer kan, ud over at være vigtige diagnostiske og prognostiske markører hos patienter med MPN, blive et vigtigt terapeutisk mål i en undergruppe af patienter med MPN i fremtiden.