Laine begyndte ikke at synge professionelt før hun var midt i tyverne. Hendes tidlige indflydelser som sangerinde var Ella Fitzgerald, Sarah Vaughan, Judy Garland og Lena Horne. I en alder af 24 år aflagde hun med succes prøve for John Dankworths lille gruppe, Dankworth Seven, og senere for hans orkester, som hun optrådte med indtil 1958. Dankworth og Laine blev gift samme år i hemmelighed på Hampstead Register Office. De eneste vidner var parrets ven, pianisten Ken Moule, og Dankworths arrangør, David Lindup. Parret fik to børn, som begge er succesfulde musikere i deres egen ret: Alec, der bor i USA, og Jacqui, en britisk sangerinde, der har udgivet en række album.
Hun spillede hovedrollen i et nyt stykke på Londons Royal Court Theatre, hjemsted for den nye bølge af dramatikere i 1950’erne som John Osborne og Harold Pinter. Dette førte til andre sceneoptrædener, såsom musicalen Valmouth i 1959, stykket A Time to Laugh (med Robert Morley og Ruth Gordon) i 1962, Boots With Strawberry Jam (med John Neville) i 1968 og til sidst til hendes rolle som Julie La Verne i Wendy Toye’s opsætning af Show Boat på Adelphi Theatre i London i 1971. Show Boat havde sin hidtil længste spilletid i denne sæson i London med 910 forestillinger.
I denne periode havde hun to store pladesucceser. “You’ll Answer to Me” nåede den britiske Top 10, mens Laine var “prima donna” i Edinburgh Festival-opsætningen af Kurt Weills opera/ballet The Seven Deadly Sins fra 1961, instrueret og koreograferet af Kenneth MacMillan. I 1964 blev hendes Shakespeare and All that Jazz-album med Dankworth godt modtaget. Dankworth og Laine grundlagde Stables teateret i 1970 i det, der var den gamle staldbygning på grunden af deres hjem. Det blev en øjeblikkelig succes med 47 koncerter det første år.
Laines internationale aktiviteter begyndte i 1972 med en succesfuld første turné i Australien, hvor hun udgav seks top-100-album i løbet af 1970’erne. Kort efter blev hendes karriere i USA indledt med en koncert i New York’s Lincoln Center, efterfulgt i 1973 af den første af mange Carnegie Hall-optrædener. Der fulgte snart turnéer fra kyst til kyst i USA og Canada, og med dem fulgte en række pladealbum og tv-optrædener, bl.a. i The Muppet Show i 1977. Dette førte efter adskillige nomineringer til hendes første Grammy-pris, som anerkendelse af liveoptagelsen af hendes Carnegie-koncert fra 1983. Hun har fortsat med jævne mellemrum været på turné, bl.a. i Australien i 2005.
Hun har samarbejdet med James Galway, Nigel Kennedy, Julian Lloyd Webber og John Williams. Andre vigtige indspilninger i denne periode var duetalbum med Ray Charles (Porgy and Bess) samt Arnold Schönbergs Pierrot Lunaire, som hun modtog en Grammy Award-nominering for.
Laines forhold til musikteatret startede i Storbritannien og fortsatte i USA med hovedroller i Sondheims A Little Night Music og Franz Lehárs The Merry Widow (Michigan Opera). I 1980 spillede hun hovedrollen i Colette, en musical af Dankworth. Forestillingen begyndte på Stables teater, Wavendon, i 1979 og blev overført til Comedy Theatre, London, i september 1980. I 1985 spillede hun rollen som Princess Puffer i Broadway-musicalen The Mystery of Edwin Drood, som hun blev nomineret til en Tony for. I 1989 modtog hun Los Angeles-kritikernes ros for sin fremstilling af heksen i Sondheims Into the Woods.
I maj 1992 optrådte Laine sammen med Frank Sinatra til en uges koncerter i Royal Albert Hall i London.
I slutningen af 1990’erne var der udsolgt til Laines koncerter over hele verden, som regel støttet af Dankworth med sit band, orkester eller mindre gruppe. Hendes sædvanlige band bestod af John Horler (klaver), Alec Dankworth (bas), Allan Ganley (trommer) og Mark Nightingale (trombone).
Laines selvbiografi, Cleo, blev udgivet i september 1994 af Simon & Schuster. Hendes anden bog, You Can Sing If You Want To, blev udgivet af Victor Gollancz i oktober 1997. I 2000 optrådte hun som sangerinden Gwen i filmen The Last of the Blonde Bombshells.
I 1997 blev Laine i forbindelse med nytårets æresliste udnævnt til Dame Commander, og hun blev udnævnt til Dame Cleo Laine DBE. På listen over nytårshonoreringer i 2006 blev hendes mand udnævnt til ridder bachelor og blev Sir John Dankworth. De var et af de få par, hvor begge partnere havde deres titel i deres egen ret, og det eneste par i jazzen, der blev anerkendt på denne måde.
Dankworth døde den 6. februar 2010, få timer før en planlagt koncert på Stables teateret i Wavendon for at fejre stedets 40-års jubilæum. Han havde været syg i flere måneder efter en koncertturne i USA. Trods sin sorg optrådte Laine ved koncerten til 40-års jubilæet sammen med John Dankworth Big Band og flere medlemmer af sin familie – og meddelte først hans død til sidst. Laines beslutning om at optræde blev omtalt på avisforsider over hele verden, herunder et helt fotografi af hende på forsiden af The Times.
En uge efter Dankworths død trådte Laine ind i stedet for sin afdøde mand og optrådte igen ved en koncert i Pinner i det nordvestlige London. Laine fortsatte med at optræde og give interviews i månederne efter Dankworths død. Hun optrådte som hovednavn på Music in the Garden-festivalen på Wavendon i juni og juli 2010.
I marts 2010 blev Laine og Dankworths sidste musikalske samarbejde udgivet på cd og til download – Jazz Matters. Indspilningen viste Dankworth Big Band, der spillede nye kompositioner skrevet af Dankworth til parrets optræden ved Proms 2007 i Royal Albert Hall.
Laine er berømt ikke kun for sin fortolkningsstil, men også for sit næsten fire oktaver brede spændvidde og sin stemmemæssige tilpasningsevne. Ud over at ramme dybe soulfulde toner er Laine’s scatting og topnoter blevet hendes signatur. Selv om hendes naturlige område er et contralto, er hun i stand til at producere et G over højt C. Derek Jewel fra Sunday Times kaldte hende “ganske enkelt den bedste sangerinde i verden”
.