En kimære var et væsen i den græske mytologi, der normalt blev fremstillet som en sammensætning af en løve, en ged og en slange. Nutidig brug af udtrykket “chimerisme” inden for hæmatopoietisk celletransplantation stammer fra denne idé om en “blandet” enhed, der henviser til en person, der har modtaget en transplantation af genetisk forskelligt væv. En test for kimerisme efter en hæmatopoietisk stamcelletransplantation indebærer identifikation af modtagerens og donorens genetiske profiler og derefter evaluering af omfanget af blandingen i modtagerens blod, knoglemarv eller andet væv.
Test for kimerisme (engraftmentanalyse) ved hjælp af DNA anvender en metode, der almindeligvis anvendes ved identitetsundersøgelser af mennesker, og som opnås ved analyse af genomiske polymorfismer kaldet short tandem repeat (STR) loci. Disse loci består af en DNA-kernesekvens, der gentages et variabelt antal gange inden for et diskret genetisk locus. Udtrykket STR, der også kaldes mikrosatellitter, henviser til antallet af basepar i en tandemvis gentaget kerne-DNA-sekvens, der varierer fra 2-8 basepar i længde. Disse loci har alleler, der kan have forskellig længde fra individ til individ og nedarves som kodominante Mendelske træk. STR-loci er blevet identificeret i hele det menneskelige genom, og nogle loci har mere end 25 alleler.
DNA-sekvensoplysninger inden for de bevarede flankerende regioner af loci anvendes til at skabe oligonukleotidprimerpar til STR’erne. Disse primere anvendes til PCR-amplifikation (polymerasekædereaktion) af testprøver. Denne teknik kan amplificere STR-sekvensen op til en milliard gange, hvilket giver materiale, der kan adskilles med en elektroforese-gel eller ved kapillarelektroforese (CE). Genotypebestemmelse foretages ved evaluering af DNA-fragmentstørrelserne. Der kan anvendes reference til en allelisk stige til nøjagtig identifikation af STR-alleler.
Det PCR-baserede STR/CE-system har flere fordele i forhold til andre analysemetoder. Amplifikationen af flere STR-loci kan kombineres (multiplexes) i et enkelt rør, hvilket muliggør analyse af op til 16 loci i én reaktion. Da der kræves meget små mængder DNA, kan der anvendes prøver med lavt celleantal, og den lille størrelse af STR-allelerne gør det endda muligt at anvende nedbrudte DNA-prøver. De digitale data letter analyse og arkivering, og CE-processen er både hurtig og omkostningseffektiv. PCR-amplifikation og analyse af STR-loci giver en hurtig og pålidelig metode til evaluering af engraftmentstatus i forbindelse med stamcelletransplantation.
Den aktuelt anvendte teknologi muliggør co-amplifikation og trefarvedetektion af seksten loci, som er underopdelt i 3 sæt af 5 eller 6 loci, der udviser amplificerede fragmenter med ikke-overlappende størrelsesintervaller.
Under PCR-amplifikationen mærkes de amplificerede fragmenter med fluorescerende farvestoffer. Efter PCR-amplifikationen behandles prøverne på et kapillarelektroforese (CE)-system.
Dataanalysen lettes af en fragmentanalysesoftware, der størrelsesbestemmer DNA-fragmenterne ved hjælp af en intern lane-standard, der køres sammen med prøven, og tildeler genotyper ved sammenligning med en STR-allel-stige, der indgår i CE-kørslen. Dette giver forskellige STR-genotypiske profiler for donoren og for transplantatmodtageren. STR-loci, der er polymorfe (dvs. informative) mellem disse personer, anvendes til at vurdere de relative mængder af modtager- og donor-DNA i prøven efter transplantationen.
De testede prøver kan stamme fra ethvert materiale, der indeholder DNA, herunder knoglemarv, perifert blod, solide tumorer, epidermal væv, hårfollikler, mundvabler og fraktionerede celleundergrupper. Da PCR-amplifikation af en prøve rutinemæssigt udføres med mindre end 2 ng genomisk DNA (svarende til ca. 300 celler), kan kimerismestning ved hjælp af denne metode udføres med succes selv for patienter med transplantationssvigt, alvorlig leukopeni eller fra fraktioner af hæmatopoietiske celleundergrupper. STR-analyse er blevet anvendt til at evaluere engraftingstatus hos patienter, der har modtaget en hæmatopoietisk celletransplantation, herunder patienter, der har modtaget dobbelte navlestrengsbloddonorenheder eller en anden transplantation fra en anden donor, samt til at bekræfte den genetiske identitet af formodede enæggede tvillinger og til at påvise inutero afledte modercelletransplantationer hos patienter med diagnosen SCID (Severe Combined Immunodeficiency). STR/CE-analyse er en hurtig, pålidelig, præcis og reproducerbar procedure.
Begrænsninger ved analysen
- Der skal isoleres tilstrækkeligt med DNA fra testprøverne til at muliggøre en robust PCR-amplifikation. Der skal være DNA-isolationsmetoder til rådighed til håndtering af prøver med lavt celletal, som f.eks. kan forekomme hos recipienter med transplantationssvigt og fra flowcytometriske linjeartsspecifikke sorterede delmængder af hvide blodlegemer. Prøverne kan have for lave koncentrationer til, at de kan kvantificeres ved UV-spektrofotometri OD260. DNA-prøver fra 5.000 til 30.000 isolerede celler giver pålideligt en acceptabel amplifikation. Laboratoriet har retningslinjer, der definerer, hvornår prøveanalysen skal gentages.
- Med de kommercielle kits har mange STR-loci informative alleler for både donor og modtager i forbindelse med ubeslægtede donorer. Antallet af informative STR-loci kan dog være begrænset til så få som 3 blandt transplantationspar med beslægtede donorer. Kvantitative værdier, der repræsenterer gennemsnittet af så få som 3 STR-loci, har vist sig at være reproducerbare.
- Patienter med maligne sygdomme kan have klonale mutationer, der påvirker visse STR-loci. Et patientallel kan være fraværende på en eller flere STR-loci, når man sammenligner de alleler, der er identificeret i patientens prøve før transplantationen, med prøven efter transplantationen. I sjældne tilfælde kan der påvises en ekstra patient STR-allel på et specifikt locus, som ikke var til stede i prøven før transplantationen. I de fleste tilfælde skyldes disse anomalier sandsynligvis kromosomtranslokationer. Manglende alleler kan også være resultatet af en mutation i de STR-konserverede flankerende sekvenser, hvor PCR-primerne er placeret. Data fra STR-loci med manglende eller ekstra alleler anvendes ikke til kvantificering.
- Hvis patientens prætransplantationsceller ikke er tilgængelige, kan der efter transplantationen indsamles prøver som f.eks. mundvabler, hudbiopsi eller hårrødder. Det skal dog bemærkes, at bukkale prøver kan indeholde betydelige mængder donorceller.
- Assayet er ikke beregnet til påvisning af minimal restsygdom.
Kliniske indikationer for Chimerism Testing in Hematopoietic Cell Transplant
Rutinemæssig dokumentation efter transplantation af donor/modtagerens oprindelse af hvide blodlegemer i perifert blod og/eller marv. Dokumentationen af engraftment kan omfatte testning af liniespecifikke celleundergrupper, såsom CD3-positive T-celler og CD33-positive myeloide celler.
Evaluering af donor/modtagerceller hos patienter med utilstrækkelig marvfunktion.
Det skal bestemmes, om recidiverende eller ny malignitet er opstået fra modtager- eller donorceller.
Vurder prognostiske risici for afstødning og recidiverende malignitet.
Dokumenter persistensen af donorceller efter transplantation hos patienter med recidiverende sygdom eller før donorlymfocytinfusion (DLI).
Vurder, om der er sket transplantationsafstødning hos recipienter, der er kandidater til en anden transplantation.
Differentiér oprindelsen af donorceller hos recipienter, der har modtaget en anden transplantation med en anden donor eller en transplantation med dobbelte navlestrengsblodsenheder.
Detektere tilstedeværelsen af maternel afledte celler hos patienter, der er diagnosticeret med svær kombineret immundefekt (SCID).
Verificere den genetiske identitet af formodede enæggede tvillinger.
Hyppigt stillede spørgsmål
Spørgsmål: Hvordan analyseres flere donorer?
Svar:
Spørgsmål: Hvordan analyseres flere donorer? Det er vigtigt at identificere STR-lokationer, der viser mindst én unik STR-allel for patienten og hver donor.
Spørgsmål: Hvordan analyseres et STR-allel? Hvorfor testes moderens engraftment?
Svar: Patienter med diagnosen SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency) kan være blevet podet med hæmatopoietiske celler af moderlig oprindelse inutero. Visse stamme-specifikke celleundergrupper (især CD3-positive celler) kan overvejende eller udelukkende være af moderlig oprindelse.
Spørgsmål: Hvad er forskellen mellem “fuld” og “blandet” kimerisme?
Svar: Hvad er forskellen mellem “fuld” og “blandet” kimerisme? “Fuld” kimerisme anvendes til at henvise til en patient, som efter transplantationen udviser en fænotype i hæmatopoietiske celler, der udelukkende er af donoroprindelse.
“Blandet” kimerisme henviser til en patient, som efter transplantationen udviser en blanding af patient- og donorfænotype i hæmatopoietiske celler.
Spørgsmål: Hvad sker der, hvis der ikke foreligger en recipientbasisprøve?
Svar: Der er flere muligheder for at få en recipientprøve efter transplantation: Prøver fra mundvigen, hårrødder eller hudbiopsier kan anvendes til en recipientbasislinjeprøve. Buccal wipe-prøver bør anvendes med forsigtighed, da donorceller kan være til stede i betydelige mængder i buccalprøver.
Spørgsmål: Hvad sker der, hvis der ikke er en donorbaselineprøve til rådighed?
Svar: Hvis donoren er i live, skal der udtages en ny blodprøve. Hvis donoren ikke er i live, bør prøver efter transplantationen sammenlignes med patientens prætransplantationsbasislinje for at identificere STR-alleler, der påvises, men som ikke er af patientens oprindelse.
Spørgsmål:
Svar: Hvorfor er HLA ikke et praktisk middel til at overvåge engraftment?
Svar: Transplantatdonorer udvælges for at være så tæt matchet med modtageren som muligt. Der er ingen HLA-markører, der adskiller modtageren og donor, når de er matchede, og kun en eller to, hvis de ikke er matchede. Desuden er andre teknologier ofte mere følsomme til dette formål end overvågning af HLA-mismatchede alleler; følgelig anvendes andre loci til at give unikke profiler.
Spørgsmål: Hvad er et informativt STR-lokus?
Svar: Hvad er et informativt STR-lokus?
Svar: Dette er et locus med mindst én allel, der er unik for modtageren eller donoren. For at være nyttig til beregninger af kimerisme skal et locus have alleler, der er unikke for begge dele. Der kan være et stort antal informative loci, når der anvendes en ubeslægtet donor til transplantationen, men meget få, hvis der anvendes en matchet søskende. På grund af forskelle i amplifikationseffektiviteten af allelerne på de enkelte locus er det at foretrække at få middel- eller medianværdier fra flere loci for at øge nøjagtigheden. Resultater fra individuelle loci er pålideligt reproducerbare, så selv et enkelt locus kan bruges til at trende sekventielle prøver.
Spørgsmål: Hvad er locus “amelogenin”, som indgår i nogle amplifikationspaneler?
Svar: Hvad er locus “amelogenin”, som indgår i nogle amplifikationspaneler?
Svar: Amelogenin-genet er placeret på X- og Y-kromosomerne. Det er ikke en STR, men viser forskellige størrelser af produkter på de respektive kromosomer. Det gør det nyttigt til bestemmelse af køn. Det indgår i primerpanelet hos kommercielle kitleverandører, der henvender sig til retsmedicinere, hvor X/Y-differentiering anvendes i vid udstrækning. Den anvendes generelt ikke til kimerismeanalyse, da den ikke kan give en unik kvindelig markør (en mandlig prøve indeholder altid en X-allel); den er heller ikke nyttig ved evaluering af prøver efter en kønsmatchet stamcelletransplantation.
Spørgsmål: Hvordan adskiller STR-chimerismeanalyse sig fra genotyping?
Svar: “Genotype” henviser til de særlige alleler, der er til stede i et bestemt locus. Genotyping foretages for at fastlægge recipient- og donorprofiler i forbindelse med kimerismeundersøgelser. Når der foretages kimerismeanalyse efter en stamcelletransplantation, sammenlignes recipientens og donorens genotypiske profiler med profilen fra prøven efter transplantationen for at vurdere, hvor meget af hver komponent der er til stede.
Genotypebestemmelse anvendes også i andre scenarier, f.eks. i retsmedicin og ved afstamningstest. Retsmedicinske analytikere bruger genotyper til at identificere kilden til bevismateriale i straffesager og til at udelukke personer fra at komme i betragtning som mistænkte. De kan også identificere menneskelige rester i “John Doe”-sager og i forbindelse med massekatastrofer. Bestemmelser af forældreskab foretages på en lignende måde for at udelukke en person som mulig forælder ved at finde alleler hos barnet, som ikke passer til hverken moderen eller den formodede far.
Citeret litteratur/anbefalet læsning
Bryant E, Martin PJ. Dokumentation af engraftment og karakterisering af kimerisme efter hæmatopoietisk celletransplantation. In: Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. Hæmatopoietisk celletransplantation. 2nd ed. Malden, MA: Blackwell Science, 1998.
Bultler J. Forensic DNA typing. Elsevier Academic Press.