Amerikanske og canadiske besøgende kan anmode om et GRATIS EKSEMPEL af vores CTAB-baserede SYNERGY™ 2.0 Plant DNA Extraction Kit HER.
Isolering af DNA fra plantevæv kan være en stor udfordring, da biokemien mellem forskellige plantearter kan være ekstrem. I modsætning til dyrevæv, hvor den samme vævstype fra forskellige arter normalt har lignende egenskaber, kan planter have varierende niveauer af metabolitter og strukturelle biomolekyler. Polysaccharider og polyfenoler er to klasser af plantebiomolekyler, som varierer meget fra art til art og er meget problematiske ved isolering af DNA. Forurenende polysaccharider og polyfenoler kan forstyrre manipulationer af DNA efter isolering.
Der findes metoder, der effektivt fjerner polysaccharider og polyfenoler fra plante-DNA-præparater. Anvendelse af CTAB (cetyltrimethylammoniumbromid), et kationisk detergent, letter adskillelsen af polysaccharider under rensningen, mens tilsætningsstoffer, såsom polyvinylpyrrolidon, kan hjælpe med at fjerne polyfenoler. CTAB-baserede ekstraktionsbuffere anvendes i vid udstrækning ved oprensning af DNA fra plantevæv.
En mulighed for oprensning af DNA ved hjælp af CTAB udnytter, at polysaccharider og DNA har forskellige opløseligheder i CTAB afhængigt af koncentrationen af natriumchlorid. Ved højere saltkoncentrationer er polysacchariderne uopløselige, mens DNA ved lavere koncentrationer er uopløseligt. Ved at justere saltkoncentrationen i lysater, der indeholder CTAB, kan polysaccharider og DNA derfor udfældes forskelligt.
Polyphenoler er forbindelser, der indeholder mere end én phenolring (f.eks. tannin), en struktur, der binder sig meget effektivt til DNA. De er naturligt forekommende i planter, men dannes også, når planter har vævsskader (brunfarvning). Ved homogenisering af plantevæv syntetiseres polyfenoler af frigjort polyfenoloxidase. Tilsætning af polyvinylpyrrolidon forhindrer interaktion mellem DNA og phenolringe ved at binde polyphenolerne.
CTAB-baserede protokoller har tendens til at fungere meget godt, men en væsentlig ulempe er, at der rutinemæssigt anvendes kloroformekstraktioner til at adskille organiske opløselige molekyler fra DNA’et. Da chloroform er kræftfremkaldende, er der mange institutioner, der ikke bryder sig om brugen af det. Derfor har OPS Diagnostics udviklet en alternativ metode, der undgår chloroform; den kan findes på siden Synergy™ Plant DNA Extraction Kit.
Materialer
- CTAB-buffer: 2% cetyltrimethylammoniumbromid, 1% polyvinylpyrrolidon, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA eller CTAB-ekstraktionsbuffer
- Centrifuge (op til 14.000 x g)
- RNase A-opløsning
- Isopropanol
- 70% ethanol
- 2 ml centrifugeringsrør
- SpeedVac
- TE-buffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)
Metode
Plantprøver kan fremstilles ved kryogenisk formaling af væv i en morter og pistil efter nedkøling i flydende nitrogen. Frysetørrede planter kan formales ved stuetemperatur. I begge tilfælde er et fint pulver bedst til ekstraktion af DNA.
- For hver 100 mg homogeniseret væv anvendes 500 µl CTAB-ekstraktionsbuffer. Bland og vortex grundigt. Overfør homogenatet til et 60 °C-bad i 30 minutter.
- Efter inkubationsperioden centrifugeres homogenatet i 5 minutter. ved 14.000 x g.
- Overfør supernatanten til et nyt rør. Tilsæt 5 µl RNaseopløsning A, og inkubér ved 37 °C i 20 minutter
- Tilsæt et tilsvarende volumen chloroform/isoamylalkohol (24:1). Vortex i 5 sekunder, hvorefter prøven centrifugeres i 1 minut ved 14 000 x g for at adskille faserne. Den vandige øverste fase overføres til et nyt rør. Denne ekstraktion gentages, indtil den øverste fase er klar.
- Den øverste vandige fase overføres til et nyt rør. DNA’et udfældes ved at tilsætte 0,7 volumen kold isopropanol og inkuberes ved -20 °C i 15 minutter.
- Proven centrifugeres ved 14.000 x g i 10 minutter. Supernatanten dekanteres uden at forstyrre pellet og vaskes efterfølgende med 500 µl iskold 70 % ethanol. Ethanolen dekanteres. Restethanol fjernes ved at tørre i en SpeedVac.
- Tør pellen længe nok til at fjerne alkoholen, men uden at DNA’et tørres helt ud. DNA opløses i 20 µl TE-buffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Pelleten skal muligvis opvarmes for at blive opløst.
Optionel protokol:
Brug af silica-spin-kolonner kan give DNA af højere kvalitet. For en valgfri protokol, klik her.