DNA-methyltransferaser (MTaser), der overfører en methylgruppe fra S-adenosylmethionin til enten adenin- eller cytosinrester, findes i en lang række prokaryoter og eukaryoter. Methylering bør tages i betragtning, når DNA fordøjes med restriktionsendonukleaser, fordi spaltning kan blokeres eller forringes, når en bestemt base i genkendelsesstedet er methyleret.
Prokaryote methylering
I prokaryoter er MTaser oftest blevet identificeret som elementer i restriktions-/modificeringssystemer, der virker for at beskytte værts-DNA mod spaltning af den tilsvarende restriktionsendonuklease. De fleste laboratoriestammer af E. coli indeholder tre stedsspecifikke DNA-methylaser.
- Dam-methylase-methylering på N6-positionen af adenin i sekvensen GATC (1,2).
- Dcm-methyltransferaser-methylering på C5-positionen af den anden cytosin i sekvenserne CCAGG og CCTGG (1,3).
- EcoKI-methylase-methylering af adenin i sekvenserne AAC(N6)GTGC og GCAC(N6)GTT.
Samtlige eller alle steder for en restriktionsendonuklease kan være resistente over for spaltning, når de isoleres fra stammer, der udtrykker Dam- eller Dcm-methylaser, hvis methylase-genkendelsesstedet overlapper endonuklease-genkendelsesstedet. F.eks. er plasmid-DNA isoleret fra Dam+ E. coli fuldstændig resistent over for spaltning med MboI, som spalter på GATC-steder.
Det er ikke alt DNA isoleret fra E. coli, der er methyleret i samme omfang. Mens pBR322-DNA er fuldt modificeret (og derfor er fuldstændig resistent over for MboI-spaltning), er kun ca. 50 % af λ DNA Dam-stederne methyleret, formentlig fordi methylasen ikke har mulighed for at methylerer DNA’et fuldt ud, før det pakkes ind i fagehovedet. Som følge heraf vil enzymer, der er blokeret af Dam- eller Dcm-modifikation, give delvise fordøjelsesmønstre med λ DNA.
Restriktionssteder, der er blokeret af Dam- eller Dcm-methylering, kan afmethyleres ved at klonere dit DNA i en dam-, dcm- stamme af E. coli, f.eks. dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925).
Restriktionssteder kan også blokeres, hvis der er et overlappende sted til stede. I dette tilfælde genereres en del af Dam- eller Dcm-sekvensen af restriktionsenzymsekvensen, efterfulgt af den flankerende sekvens. Denne situation bør også tages i betragtning ved udformning af restriktionsenzymdigester.
Eukaryote methylering
CpG MTaser, der findes i højere eukaryoter (f.eks. Dnmt1), overfører en methylgruppe til C5-positionen af cytosinrester. Mønstre af CpG-methylering er arvelige, vævsspecifikke og korrelerer med genekspression. Det er derfor blevet postuleret, at CpG-methylering spiller en rolle i differentiering og genekspression (4).
Note: Virkningerne af CpG-methylering er hovedsagelig et problem, når eukaryote genomisk DNA fordøjes. CpG-methyleringsmønstre bevares ikke, når DNA’et er klonet ind i en bakteriel vært.
Methyleringsfølsomhed
Tabellen nedenfor opsummerer methyleringsfølsomheden for NEB-restriktionsenzymer, der angiver, om spaltning blokeres eller forringes af Dam-, Dcm- eller CpG-methylering, hvis eller når den overlapper hvert genkendelsessted. Denne tabel skal ses som en vejledning i de anførte enzymernes adfærd snarere end som en absolut indikator. Se REBASE , restriktionsenzymdatabasen, for mere detaljerede oplysninger og specifikke eksempler, som disse retningslinjer er baseret på.
- Marinus, M.G. og Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143-1150. PMID: 4576399
- Geier, G.E.og Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408-1413. PMID: 368070
- May, M.S. og Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768-770. PMID: 1097428
- Siegfried, Z. og Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID: 9115385
Legende
| ● | Not Sensitiv | ◆ | Impaired |
| ◼ | Blokkeret | ◇ ol | Blokkeret ved overlapning |
| ◻ ol | Blokeret af overlapning | ◇ scol | Blokeret af nogle kombinationer af overlapning |
| ◻ scol | Blokeret af nogle kombinationer af overlapning | ||
Kode med et enkelt bogstav