Sanger-metoden anvendes til at amplificere et målsegment af DNA, således at DNA-sekvensen kan bestemmes præcist. Indarbejdelsen af ddNTP’er i reaktionsventilerne bruges simpelthen til at afslutte syntesen af en voksende DNA-streng, hvilket resulterer i delvist replikerede DNA-fragmenter. Dette skyldes, at DNA-polymerase kræver 3’OH-gruppen i den voksende kæde og 5′-fosfatgruppen i den indkommende dNTP for at skabe en fosfodiesterbinding. Nogle gange vil DNA-polymerasen inkorporere en ddNTP, og fraværet af 3’OH-gruppen vil afbryde kondensationsreaktionen mellem 5′-fosfatet (efter spaltning af pyrophospat) i det indkommende nukleotid og 3′-hydroxylgruppen i det foregående nukleotid på den voksende streng. Denne kondensationsreaktion ville normalt finde sted ved DNA-polymerasens inkorporering af en ikke-modificeret dNTP. I de enkleste vendinger fører nukleofilt angreb af 3’OH-gruppen til addition af et nukleotid til en voksende kæde. Fraværet af 3′-hydroxylgruppen forhindrer dette nukleofile angreb i at finde sted, hvilket gør det umuligt for DNA-polymerasen at fortsætte sin funktion.
Denne opdagelse førte til det passende navn “Chain-terminating nucleotides” (kædeafsluttende nukleotider). Dideoxyribonukleotiderne har ikke en 3′-hydroxylgruppe, hvorfor der ikke kan ske yderligere kædeforlængelse, når først dette dideoxynukleotid er på kæden. Dette kan føre til, at DNA-sekvensen afbrydes. Disse molekyler danner således grundlaget for dideoxykædeafslutningsmetoden til DNA-sekventering, som Frederick Sanger og hans team rapporterede om i 1977 som en udvidelse af tidligere arbejde. Sangers metode blev i 2001 beskrevet som en af de to grundlæggende metoder til sekventering af DNA-fragmenter (den anden er Maxam-Gilbert-metoden), men Sanger-metoden er både den “mest udbredte og den metode, der anvendes af de fleste automatiserede DNA-sekventeringsmaskiner”. Sanger fik sin anden Nobelpris i kemi i 1980 og delte den med Walter Gilbert (“for deres bidrag vedrørende bestemmelse af basesekvenser i nukleinsyrer”) og med Paul Berg (“for hans grundlæggende studier af nukleinsyrernes biokemi, især med hensyn til rekombinant-DNA”), og han diskuterede brugen af dideoxynukleotider i sin Nobelforelæsning.
DNA-sekventeringRediger
Dideoxynukleotider er nyttige i forbindelse med sekventering af DNA i kombination med elektroforese. En DNA-prøve, der underkastes PCR (polymerasekædereaktion) i en blanding, der indeholder alle fire deoxynukleotider og et dideoxynukleotid, vil producere strenge af en længde svarende til placeringen af hver base af den type, der supplerer den type, hvor der er et dideoxynukleotid til stede. Den taq-polymerase, der anvendes i PCR, favoriserer ddGNTP, hvilket har været et mønster, der er observeret i forskellige undersøgelser. Det vil sige, at hver nukleotidbase af den pågældende type har en sandsynlighed for at være bundet til ikke et deoxynukleotid, men derimod et dideoxynukleotid, hvilket afslutter kædeforlængelsen. Hvis prøven derefter underkastes elektroforese, vil der derfor være et bånd til stede for hver længde, hvor komplementet af dideoxynukleotidet er til stede. Det er nu almindeligt at anvende fluorescerende dideoxynukleotider, således at hver af de fire har en anden fluorescens, som kan detekteres af en sekvenseringsmaskine; der er således kun behov for én reaktion.