Effekt af tilskud af antioxidantmineralelementer ved behandling af hypertension hos albinorotter

Abstract

Oxidativ stress er blevet impliceret i forskellige patologier, herunder hypertension, åreforkalkning, diabetes og kronisk nyresygdom. Det aktuelle arbejde blev designet med det formål at undersøge potentialet af antioxidanterne kobber, mangan og zink i behandlingen af hypertension hos Wistar rotter. Rotterne blev fodret med 8% NaCl-diæt i 5 uger og behandlet med kosttilskud i tilstedeværelse af det udfordrende middel i yderligere 4 uger. Tilskuddet sænkede blodtrykket signifikant sammenlignet med den hypertensive kontrol. Resultatet viste også et signifikant fald i niveauerne af total kolesterol, triglycerid, low-density lipoproteinkolesterol og very low-density lipoproteinkolesterol, malondialdehyd, insulin og en stigning i high-density lipoproteinkolesterol, total antioxidant aktivitet og nitrogenoxid i de grupper, der fik tilskud, sammenlignet med den hypertensive kontrol. Den gennemsnitlige procentvise beskyttelse mod aterogenese viste 47,13 ± 9,60 % for alle de tilførte grupper. Det gennemsnitlige arterielle blodtryk viste en signifikant positiv korrelation med glukose, totalkolesterol, triglycerid, low-density lipoproteinkolesterol, very low-density lipoproteinkolesterol, atherogent indeks, insulinresistens og malondialdehyd, mens high density lipoproteinkolesterol og total antioxidant aktivitet viste en negativ korrelation. Resultatet indikerede derfor en stærk sammenhæng mellem oxidativt stress og hypertension og understreger antioxidantmineralers rolle i forbindelse med reduktion af oxidativt stress, dyslipidæmi og insulinresistens i forbindelse med hypertension.

1. Indledning

Hypertension er en af de mest almindelige sygdomme verden over og en af de vigtigste dødsårsager på grund af kardiovaskulær svigt. På grund af den tilknyttede morbiditet og mortalitet er hypertension et folkesundhedsproblem , og derfor bør sundhedsvæsenet være opmærksom på behovet for at finde passende forebyggelses- og forvaltningsstrategier. Øget vaskulært oxidativt stress kan være involveret i patogenesen for hypertension, som er en væsentlig risikofaktor for hjerte-kar-sygdomme og dødelighed i de udviklede lande og udviklingslandene. Hypertension skyldes komplekse interaktioner mellem genetisk prædisponering og miljømæssige faktorer. Øget saltindtagelse kan forværre stigningen i blodtrykket og udviklingen af følgeskader i slutorganerne .

Det nye koncept, at strukturelle og funktionelle abnormiteter i vaskulaturen, herunder endotel dysfunktion, øget oxidativ stress og nedsat antioxidant aktivitet, kan gå forud for hypertension og bidrage til dens patogenese, har fået støtte i de seneste år . Dyreforsøg har generelt støttet hypotesen om, at øget blodtryk er forbundet med øget oxidativt stress . Forhøjede lipidperoxidationsbiprodukter og nedsat aktivitet af antioxidantsystemer er blevet rapporteret hos personer med forhøjet blodtryk . Flere undersøgelser har vist en stigning i niveauerne ved hypertension og implicerer NADPH-oxidase som en kilde til overskuddet .

Angiotensin II har vist sig at være en potent aktivator af NADPH-oxidaseaktivitet i vaskulær glat muskel, endotelceller og kardiomyocytter . Et fælles fund i alle typer hypertension samt diabetes og metabolisk syndrom er endotel dysfunktion, karakteriseret ved en ubalance i ekspressionen af og følsomheden over for vasodilaterende og vasokonstriktoriske midler, hvilket resulterer i øget vaskulær tone og dermed en stigning i modstand mod flow .

Kobber, mangan og zink betegnes almindeligvis som antioxidantmineraler, der er nødvendige for aktiviteten af nogle antioxidante enzymer. Hiroyuki et al. rapporterede, at zinkmangel kan spille en afgørende rolle i udviklingen af genetisk hypertension formodentlig gennem den oxidative stress forårsaget af hypertension. Det er kendt, at superoxidanioner hurtigt inaktiverer den af endothelium afledte vasodilator, nitrogenoxid, og derved fremmer vasokonstriktion . Forsøg på at modvirke de hypertensive virkninger af reaktive oxygenarter har derfor ført til anvendelse af eksogene antioxidanter til at forbedre den vaskulære funktion og reducere blodtrykket i dyremodeller og hypertension hos mennesker . Derfor danner evalueringen af den potentielle virkning af antioxidanterne kobber, mangan og zink i forbindelse med behandling af hypertension grundlaget for denne undersøgelse.

2. Metoder

2.1. Kemikalier og reagenser

Der blev anvendt analytisk sorterede kemikalier og reagenser til denne undersøgelse. Kobbersulfat og mangansulfat blev indkøbt hos May and Baker, England, mens zinksulfat stammede fra J.T. Baker chemical company, Philipsburg, New Jersey.

2.2. Forsøgsdyr

Han wistarrotter med en vægt på mellem 150-180 g blev indkøbt fra det veterinærmedicinske fakultet, Usmanu Danfodiyo University, Sokoto, Nigeria, og fik lov til at akklimatisere sig i to uger, inden forsøget blev påbegyndt. Dyrene blev inddelt i seks grupper på hver 5 rotter, og de blev fodret med pelleteret foder (Vital feed, Jos, Nigeria) og fik adgang til vand ad libitum i hele forsøgsperioden. Forsøgsprotokollen blev godkendt af den etiske komité ved Usmanu Danfodiyo University, Sokoto, Nigeria.

2.3. Induktion af hypertension

Råtterne blev placeret på en diæt med højt saltindhold (8% NaCl) undtagen normotensiv kontrol i 9 uger ved at tilføje 8% NaCl til foderet. Behandlingen påbegyndtes fra den 6. uge med saltbelastning.

2.4. Måling af blodtryk

Blodtrykket blev overvåget ugentligt ved hjælp af halemuffemetoden ved hjælp af ikke-invasiv Ugo Basile, serie 58500 blodtryksregistreringsapparat. Der blev taget et gennemsnit af fire aflæsninger for hver rotte, og rotternes temperatur blev overvåget i hele måleperioden. Det gennemsnitlige arterielle blodtryk blev beregnet i henhold til følgende ligning: hvor SP og DP er henholdsvis systolisk og diastolisk tryk.

2,5. Fremstilling af kosttilskud

Kobber, mangan og zink blev fremstillet ved at opløse kobbersulfat, mangansulfat og zinksulfat i destilleret vand for at opnå henholdsvis 2,5 mg/mL kobber, 2,4 mg/mL mangan og 11 mg/mL zink. Alle kosttilskud blev tilberedt lige før indgift.

2.6. Gruppering af dyr og behandling

Gruppe I Normal ubehandlet/destilleret vand. Gruppe II Hypertensiv kontrol/distilleret vand. Gruppe III Saltbelastet behandlet med 4 mg/kg kobber. Gruppe IV Saltbelastet behandlet med 10 mg/kg mangan. Gruppe V Saltbelastet behandlet med 20 mg/kg zink. Gruppe VI Saltbelastet behandlet med 4 mg/kg kobber, 10 mg/kg mangan og 20 mg /kg zink.

Koncentrationerne af kosttilskud blev valgt på grundlag af den anbefalede kosttilførsel, og de passende doser blev administreret oralt til de behandlede grupper i forhold til deres kropsvægt ved intubation ved hjælp af intravenøs kanyle i 4 uger. Fireogtyve timer efter den sidste behandling blev dyrene bedøvet med kloroformdamp, og der blev udtaget fasteblodprøver gennem hjertepunktur i mærkede rør med henblik på biokemiske analyser. Vægtændringer hos rotterne blev overvåget i hele forsøgsperioden.

2.7. Estimering af biokemiske parametre

Blodprøven fik lov til at koagulere og blev centrifugeret ved 4000 g i ti minutter, og det opnåede serum blev anvendt til estimering af glukose, lipidprofil, total antioxidantstatus, insulin, superoxiddismutase, katalase og nitrogenoxid. Dyrene blev ofret, og leveren af hver rotte blev dissekeret og skyllet med iskold saltvand for at fjerne blodet. Der blev fremstillet et 10 % homogenat i iskold 0,1 M Tris-buffer, pH 7,4, ved hjælp af en homogenisator. Homogenatet blev centrifugeret ved 4000 g i 15 minutter. Supernatanterne blev anvendt til estimering af thiobarbiturinsyre reaktivt stof (TBARS) og glutathionperoxidaseaktivitet.

Det faste serumglukoseniveau blev estimeret ved glukoseoxidasemetoden . Serum total kolesterol , triglycerid og højdensitetslipoproteinkolesterol blev bestemt ved enzymatisk metode.

Serum lavdensitetslipoproteinkolesterol og meget lavdensitetslipoproteinkolesterol blev beregnet efter formlen af friedewald et al. . Aterogent indeks blev beregnet som forholdet mellem LDL-kolesterol og HDL-kolesterol .

Kolorimetrisk metode blev anvendt til estimering af serum total antioxidantstatus og vævsmalondialdehyd .

Cayman’s Superoxide Dismutase Assay Kit blev anvendt til estimering af SOD. Assayet anvender et tetrazoliumsalt til påvisning af superoxidradikaler, der genereres af xanthinoxidase og hypoxanthin ved 450 nm. En enhed SOD er defineret som den mængde enzym, der er nødvendig for at udvise 50 % dismutation af superoxidradikalerne.

Katalaseaktiviteten blev vurderet ved hjælp af Cayman’s Catalase Assay Kit. Metoden er baseret på enzymets reaktion med methanol i nærvær af en optimal koncentration af H2O2. Den dannede formaldehyd er målt med 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol (Purpald) som kromogen ved 540 nm.

Glutathionperoxidaseaktivitet blev analyseret ved hjælp af Cayman’s Assay Kit. Dette assay måler glutathionperoxidaseaktiviteten indirekte ved en koblet reaktion med glutathionreduktase. Oxideret glutathion, der produceres ved reduktion af hydroperoxid ved hjælp af glutathionperoxidase, genanvendes til sin reducerede tilstand af glutathionreduktase og NADPH. Oxidationen af NADPH til NADP+ ledsages af et fald i absorbansen ved 340 nm.

Nitrogenoxid blev estimeret ved hjælp af Cayman’s Assay Kit. Assayet giver en nøjagtig og bekvem metode til måling af den samlede nitrat/nitrit-koncentration i en enkel totrinsproces. Det første trin er omdannelsen af nitrat til nitrit ved hjælp af nitratreduktase. Det andet trin er tilsætning af Griess-reagenset, som omdanner nitrit til en dyb lilla azoforbindelse.

Insulin blev estimeret ved hjælp af SPI biorat insulin enzymimmunoassay-kit. Testen er baseret på konkurrence mellem umarkeret rotteinsulin og acetylcholinesterase, der er knyttet til rotteinsulin (tracer), om begrænsede specifikke steder med marsvins-anti-rosinsulin-antiserum. Pladen blev derefter vasket, og Ellman-reagens blev tilsat til brøndene, hvorefter acetylcholinesterase-tracerstoffet virker på Ellman-reagenset og danner en gul forbindelse, der bestemmes ved 405 nm.

Insulinresistensindekset blev beregnet ved hjælp af Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance (HOMA-IR) . Procentvis beskyttelse mod atherogenese blev beregnet ved hjælp af følgende ligning

2,8. Statistisk analyse

Værdierne er udtrykt som gennemsnitlig standardafvigelse for 5 rotter i hver gruppe. Resultatet blev analyseret statistisk ved hjælp af envejs variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest ved hjælp af GraphPad Instat-software. Forskelle blev betragtet som signifikante, når .

3. Resultater

Vægttilvæksten hos rotterne (figur 1) viste, at saltbelastet ubehandlet kontrol tog mere på i vægt () end de behandlede grupper og normotensiv kontrol. Supplering viste signifikant () effekt på rotternes vægtændringer sammenlignet med den hypertensive kontrol.

Figur 1

Vægtforøgelse af saltinduceret hypertensiv behandlet med antioxidantmineraler. Grp I: normal ubehandlet, Grp II: hypertensiv ubehandlet, Grp III: saltbelastet behandlet med kobber, Grp IV: saltbelastet behandlet med mangan, Grp V: saltbelastet behandlet med zink og Grp VI: saltbelastet behandlet med mineraler kombineret sammenlignet med gruppe II.

Der var en signifikant () stigning i det gennemsnitlige arterielle blodtryk hos de saltbelastede rotter (Figur 2). Supplering forårsagede et signifikant fald i det gennemsnitlige arterielle blodtryk i de behandlede grupper i forhold til den hypertensive kontrol.

Figur 2

Effekt af saltdiæt og tilskud af antioxidanter på det gennemsnitlige arterielle blodtryk hos saltbelastede rotter. Uge 1-5: kun saltdiæt, uge 6-9: saltdiæt plus kosttilskud, MABP-middelværdi af arterielt blodtryk Grp I: normal ubehandlet, Grp II: hypertensiv ubehandlet, Grp III: saltbelastet behandlet med kobber, Grp IV: saltbelastet behandlet med mangan, Grp V: saltbelastet behandlet med zink, og Grp VI: saltbelastet behandlet med mineraler kombineret.

Saltbelastning forårsagede en betydelig stigning i serumglukose, insulin og insulinresistens (tabel 1), og tilskud med mineralelementerne vender tendensen.

Effekt af tilskud på serumlipidprofilen og det atherogene indeks er præsenteret i tabel 2. Resultatet viste et signifikant fald i niveauerne af TC, TG, LDL-C, VLDL-C og AI og en stigning i HDL-C sammenlignet med den saltbelastede ubehandlede gruppe.

Den % beskyttelse mod atherogenese (figur 4) viste en signifikant () stigning i % beskyttelse i gruppen suppleret med mineraler kombineret sammenlignet med grupperne med kobber, mangan og zink. Gruppen behandlet med mineraler kombineret viste den højeste beskyttelse på 60,79 %, mens gruppen suppleret med mangan viste den laveste beskyttelse på 38,76 %.

Figur 4

Procentvis beskyttelse mod aterogenese hos saltinducerede hypertensive rotter suppleret med mineraler Grp I: normal ubehandlet, Grp II: hypertensive ubehandlet, Grp III: saltbelastet behandlet med kobber, Grp IV: saltbelastet behandlet med mangan, Grp V: saltbelastet behandlet med zink, Grp VI: saltbelastet behandlet med mineraler kombineret sammenlignet med grp VI.

Effekten af tilskud på den samlede antioxidantstatus, nitrogenoxid og MDA (tabel 3) viste en signifikant stigning i niveauerne af TAS mellem ubehandlet gruppe og mangan () og mineral kombineret () grupper. Resultatet viste også et signifikant () fald i vævets MDA i de tilførte grupper sammenlignet med den ubehandlede kontrol. Endothelfunktionen blev også forbedret efter tilskuddet.

Resultatet af effekten af tilskud på antioxidantenzymer er præsenteret i tabel 4. Resultatet viste, at tilskud øgede aktiviteterne af kat, Gpx og SOD sammenlignet med hypertensiv kontrol.

Korrelationskoefficient () af MABP mod glukose, insulinresistens, lipidprofil og oxidative stressmarkører er præsenteret i figur 5. Resultatet viste en signifikant positiv korrelation mellem MABP og glukose, insulin, insulinresistens, TC, TG, LDL-C, VLDL-C, AI og MDA, mens HDL-C, TAS, SOD, Cat og GPx viste en negativ korrelation med MABP.

Figur 5

Korrelationskoefficient () for MABP over for glukose, insulinresistens, lipidprofil og oxidative stressmarkører. MABP: gennemsnitligt arterielt blodtryk, Glc: glukose, HOMA-IR: Homeostasis Model Assessment-Insulinresistance GPx: glutathionperoxidase, SOD: superoxiddismutase, TC: totalkolesterol, TG: triglycerid, HDL-C: lipoproteinkolesterol med høj densitet, LDL-C: lavdensitetslipoproteinkolesterol, VLDL-C: meget lavdensitetslipoproteinkolesterol, AI: aterogent indeks, vit: vitamin, TAS: samlet antioxidantstatus, MDA: malondialdehyd, NO: nitrogenoxid ES: ekstremt signifikant, VS: meget signifikant, S: signifikant, og NS: ikke signifikant.

4. Diskussion

Hypertension er blandt de mest udbredte risikofaktorer for kardiovaskulære sygdomme . I denne model blev en kost med 8% NaCl anvendt til at fremkalde hypertension hos wistarrotter i 5 uger og saltbelastet kost med tilskud i yderligere 4 uger. Højt saltindhold er blevet rapporteret til at forårsage hypertension hos rotter . Den mekanisme, hvormed diæter med højt saltindhold inducerer hypertension, kan skyldes en stigning i det cirkulerende natriumniveau, som får cellerne til at frigive vand på grund af det osmotiske tryk, hvilket øger trykket på blodkarvæggene . Andre mulige mekanismer kunne til dels skyldes en stigning i plasmaets evne til at hæmme , -Adenosin Triphosphotase , som hæver blodtrykket ved at hæmme natrium-kalciumudvekslingspumpen i den glatte vaskulære muskulatur , eller at natriumdiæten er forbundet med øget intrarenal angiotensin II , som kan resultere i renal vasokonstriktion og øget renal produktion på grund af aktivering af NADPH oxidase . Overproduktion af superoxidanioner og andre frie radikaler som følge af aktivering af NADPH-oxidase kan overvælde antioxidantkapaciteten og forårsage ubalancer mellem oxidant- og antioxidantstatus, hvilket kan resultere i oxidativt stress. Resultatet viste, at saltbelastning øgede det arterielle blodtryk hos rotterne, og at tilskud med antioxidantmineraler forhindrer forhøjelsen af blodtrykket. Observationen bekræfter rapporten om, at saltbelastning af forskellige rottestammer såsom Sprague-Dawley-rotter og wistarrotter resulterer i øget blodtryk.

Gruppen, der fik tilskud af mineraler kombineret, normaliserede næsten det gennemsnitlige arterielle blodtryk, hvilket tyder på, at kombinationsbehandling synes at være mere effektiv med hensyn til blodtryksreduktion end enkeltstående tilskud af antioxidantmineraler.

Den blodtrykssænkende effekt af kobber, mangan og zink i denne model kunne tilskrives deres frie radikalfangende egenskaber, som mindsker kvælning af nitrogenoxid ved hjælp af superoxidanion, mindsker NADPH-oxidaseaktiviteten eller øger superoxiddismutaseaktiviteten, da disse mineraler udgør en væsentlig og integreret del af superoxiddismutase. Resultatet af det aktuelle arbejde bekræfter rapporten om, at tilskud af zink sænker blodtrykket hos saltbelastede hypertensive rotter .

De øgede niveauer af triglycerid, total kolesterol, low-density lipoprotein-kolesterol og meget low-density lipoprotein-kolesterol og faldet i high density lipoprotein-kolesterol observeret hos hypertensive rotter sammenlignet med den supplerede gruppe bekræftes med flere undersøgelser . Den mulige mekanisme, der ligger til grund for forholdet mellem øgede niveauer af HDL-C og nedsat LDL-C og kardiovaskulært resultat af hypertension efter tilskud i denne undersøgelse, kan skyldes øget syntese eller nedsat nedbrydning af HDL-C, der kan mindske de oxiderede lipidarter i LDL-partikler og derved beskytte dem mod atherogenese. Dette kunne faktisk afspejle udgangspunktet for beskyttelsen mod åreforkalkning. Resultatet viste også et fald i niveauerne af glukose, insulin, insulinresistens, malondialdehyd og øget nitrogenoxid i de grupper, der fik tilskud, sammenlignet med den hypertensive kontrolgruppe. Den forbedrede endothelfunktion og insulinfølsomhed, der blev observeret i de grupper, der fik tilskud, bekræfter den rolle, som antioxidanterne kobber, mangan og zink spiller i behandlingen af hypertension. De nøjagtige molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse mineralers antioxidante virkninger på insulinfølsomhed og endothelfunktion, blev således ikke fuldt ud fastlagt i denne model, men kunne formidles gennem undertrykkelse af oxidativt stress, hvilket resulterede i en forbedring af antioxidantstatus og endothelfunktion, hvilket fremgik af det nedsatte niveau af lipidperoxidationsindeks, malondialdehyd, og øget nitrogenoxid, som er et mål for endothelfunktionen.

Resultaterne af undersøgelsen tyder på, at saltbelastning inducerer hypertension via oxidativt stress, da det fremkalder lipidperoxidation og påvirker aktiviteterne af antioxidantenzymer i rotterne. Dette indikeres af stigningen i den samlede antioxidantstatus og aktiviteterne af superoxiddismutase, katalase og glutathionperoxidase efter tilskud med antioxidantmineraler, som blev overvældet på grund af oxidativ stress induceret af salt.

Det blev også forsøgt at korrelere det gennemsnitlige arterielle blodtryk med alle de biokemiske parametre, der blev vurderet i vores model, for at bestemme graden af sammenhæng mellem disse variabler. Resultatet viste en signifikant positiv korrelation mellem det gennemsnitlige arterielle blodtryk og glukose, total kolesterol, triglycerid, low density lipoprotein-kolesterol, very low density lipoprotein-kolesterol, atherogenic index, insulinresistens og malondialdehyd, mens high-density lipoprotein-kolesterol, total antioxidantstatus, katalase, superoxiddismutase og glutathionperoxidase viste en signifikant negativ korrelation.

Den positive korrelation mellem MABP og malondialdehyd tyder på, at en stigning i blodtrykket resulterede i en større produktion af thiobarbiturinsyre-reaktive stoffer, og tilskud mindskede både MABP og MDA. Den negative korrelation mellem MABP og den samlede antioxidantstatus, katalase, SOD og glutathionperoxidase viser, at en stigning i MABP nedregulerede aktiviteterne af disse enzymer og nedsatte TAS, hvilket kan tilskrives produktionen af overskydende frie radikaler, men tilskud forbedrer virkningerne.

Disse observationer bekræftede yderligere den rolle, som oxidativ stress spiller i hypertension, og tilskud med antioxidantmineraler har potentiale til at forebygge eller forsinke de kardiovaskulære komplikationer af hypertension, da vores resultater giver antioxidantbeskyttelse. Det er imidlertid ikke klart, om stigningen i mængden af reaktive oxygenarter er en konsekvens af hypertension eller ej.

5. Konklusion

Resultatet bekræftede den rolle, som oxidativt stress spiller i hypertension, og understreger kobberets, mangans og zinks rolle i forsinkelse og behandling af kardiovaskulære komplikationer ved hypertension.