Hjertesvigt er et folkesundhedsproblem, der i høj grad påvirker den daglige håndtering og livskvaliteten hos mange berørte personer2. Større depression ved kronisk hjertesvigt og dens stigende rolle i forbindelse med hjertesvigtdødeligheden er et yderligere problem3. Selv om magiske svampe har været anvendt i oldtiden og i nyere tid til sindhelbredelse og er kendt for at forbedre livskvaliteten, er deres sikkerhed ved hjerte-kar-sygdomme som f.eks. hjertesvigt ikke kendt. Vores undersøgelse undersøgte for første gang virkningerne af varmt- og koldtvandsekstrakter af Panaeolus cyanescens og Psilocybe cubensis magiske svampe på ET-1, en vigtig fysiologisk inducerende faktor for hypertrofiske ændringer in vitro på rotte H9C2-kardiomyocytter, hvor vi evaluerer sikkerheden eller ekstrakternes evne til at forværre disse virkninger. Protokolmodellen med H9C2-kardiomyoblastceller in vitro, der blev anvendt i undersøgelsen, blev valgt på baggrund af deres etablerede og dokumenterede evne til at udvise fysiologiske reaktioner, der er nyttige i forbindelse med opdagelse af lægemidler til kardiovaskulær medicin17. Resultaterne fra undersøgelsen viste, at behandling med ET-1 signifikant øgede cellestørrelserne, BNP-niveauerne i de stimulerede celler og nedsatte mitokondriel aktivitet signifikant som angivet ved cellens levedygtighed sammenlignet med de ikke-inducerede NO-ET1-celler. Disse virkninger var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der indikerer vellykket cellulær ET-1-induceret hypertrofi i vores undersøgelse18.
Vandekstrakterne af P. cubensis og Pan cyanescens-svampe reducerede signifikant de ET-1-inducerede cellestørrelsesmålinger af behandlede celler på samme måde som den positive kontrol, ambrisentan, som selektivt blokerer ETA-receptoren og hæmmer ET-1’s prohypertrofiske egenskaber. De fire vandekstrakter reducerede også signifikant de ET-1-inducerede koncentrationer af BNP, et af de velkendte hallmærkepeptider for hjertesvigt. Som et resultat heraf vendte de fire ekstrakter de to vigtigste indekser for hypertrofi (cellestørrelse og BNP-niveauer) induceret af ET-1 betydeligt i de anvendte koncentrationer. Desuden forbedrede de fire vandekstrakter af de to tryllesvampe også cellernes mitokondrielle aktivitet, hvilket blev vist ved at øge den procentvise celleviabilitet af ET-1-inducerede celler på en dosisafhængig måde på samme måde som den positive kontrol, ambrisentan, hvilket indikerer sikkerhed ved de koncentrationer, der blev undersøgt i undersøgelsen. Endvidere reducerede de to ekstrakter af P. cubensis og varmtvandsekstrakt af Pan cyanescens-svampe TNF-α-koncentrationen i de behandlede celler sammenlignet med ET-1-inducerede kontrolceller, mens koldtvandsekstrakt af Pan cyanescens øgede den svagt og ikke-signifikant. TNF-α er et vigtigt proinflammatorisk cytokin, som er kendt for at fremme hjertedysfunktioner og bidrager til hjertesvigt19. Ved at reducere TNF-α viste de tre ekstrakter potentiel sikkerhed i forbindelse med hjertesvigt.
Mange undersøgelser har fastslået, at ROS spiller en meget vigtig rolle i udviklingen af kardiovaskulære sygdomme som f.eks. hjertesvigt ved at inducere oxidativ stress, som igen fører til celle- og vævsskader20. Superoxid- og hydroxylradikaler er blandt de mest fremtrædende ROS, der forårsager toksiske skader på det menneskelige legeme21. I vores undersøgelse målte vi ROS-niveauerne, især superoxid- og hydroxylradikaler i løbet af 1 times behandling efter 2 timers ET-1-stimulering, og resultaterne viste, at de fire vandsvampeekstrakter vendte de ET-1-inducerede ROS-niveauer betydeligt i forhold til den positive kontrol i forhold til ET-1-inducerede kontrolceller. Ved at sænke ROS-niveauerne viste ekstrakterne sikkerhed og beskyttende virkning mod ET-1-induceret oxidativ stress, som vil være gavnlig ved hjertesvigt.
Dertil kommer, at det fald i ROS, der blev observeret med ekstrakterne, ikke skyldtes toksicitet baseret på den positive stigning i cellevæksthastigheden (fig. 4), hvor % levedygtighed af cellerne fortsatte med at stige efter 1 times behandling. Det var imidlertid også ganske interessant at opfatte forskellene mellem vandekstrakterne af de to svampe på analysen af cellevæksthastigheden i forhold til NO-ET-1-cellerne. Cellerne behandlet med P. cubensis-ekstrakt efter 1 time fortsatte med at vokse med en hastighed tæt på den positive kontrol, ambrisentan og NO-ET1-cellerne, mens vandekstraktet af Pan cyanescens førte til en reduktion i cellevæksthastigheden, der var endnu langsommere end den, der blev observeret med ET-1-inducerede kontrolceller. Denne virkning viste, at selv om vandekstrakter af Pan cyanescens reducerede ROS-niveauet, indeholder de også andre forbindelser, der sænkede cellevæksthastigheden. Det er imidlertid kendt, at Pan cyanescens-svampe er unikke, idet de har et meget højt indhold af urinstof ud over psilocybin, psilocin, baeocystin og andre forbindelser, der generelt er kendt for at være til stede i magiske svampe22. Urea er også kendt for at inducere en forsinkelse af cellecyklus og fremme en langsom væksthastighed af celler i logfasen i vækst23. Dette kunne være årsagen til en sådan reduktion i cellevæksthastigheden, der blev observeret med Pan cyanescens-vandekstrakter, sammenlignet med de andre prøver. Vi observerede dog også en forbedring ændring fra 12 timer i væksthastigheden for de to vandekstrakter af Pan cyanescens, således at det kolde vand udviste den højeste væksthastighed ved 48 timers behandling. Forsigtighed er dog nødvendig med højere koncentrationer af vandekstrakter af Pan cyanescens svampesvampe, da de kan have potentiale til at inducere forsinkelse af cellecyklus i den første time efter indtagelse.
For yderligere at undersøge ekstrakternes sikkerhed ved celleskader viste resultaterne, at kardiomyocytter induceret med TNF-α stimulerede en betydelig celledød, angivet ved reduktion i de inducerede cellers levedygtighed under 80 % sammenlignet med normale ikke-inducerede celler. De fire ekstrakter af de to magiske svampe vendte den TNF-α-inducerede celleskade og -død, hvilket blev indikeret ved at øge den procentvise celleviabilitet for de behandlede celler på samme måde som den positive kontrol med quercetin på en dosisafhængig måde. Denne effekt viste den beskyttende virkning af svampeekstrakterne mod kardiomyocytskader, som vil være gavnlig i en patologisk hypertrofitilstand.
Det var desuden også interessant at observere, at selv om koldtvandsekstraktet af Pan cyanescens-svampen ikke hæmmer produktionen af TNF-α-koncentrationen i de ET-1-stimulerede celler efter 48 timer, beskyttede ekstraktet stadig mod ET-1-induceret celledød ved at øge % celleviabilitet af cellerne endnu højere end den positive kontrol og ikke-inducerede celler ved de koncentrationer, der blev anvendt i undersøgelsen, som vist i Fig. 3. Denne effekt kombineret med den beskyttende virkning af koldtvandsekstraktet på TNF-α-induceret celleskade ovenfor viser, at ekstraktet kan indeholde forbindelser, der blokerer de inducerede kardiomyocyt-apoptosekaskader, sandsynligvis ved at aktivere eller fremme ekspressioner af celledødsrepressorer. Undersøgelser har vist, at TNF-α’s apoptosevirkninger i hjertet afhænger af receptortypen, hvorved den udviser sin kardiotoksiske virkning gennem sin receptor TNFR1 (tumor necrosis factor receptor1)24,25. Efter binding til TNFR1-receptoren kan TNF-α stimulere apoptose i kardiomyocytter ved at aktivere sphingomyelin-signaltransduktionsvejen, hvilket fører til produktion af det intracellulære signalmolekyle, sphingosin25.
Sfingosin er en velkendt effektiv inducerende faktor for apoptose i kardiomyocytter, og det inducerer sin virkning ved at nedregulere ekspressionerne af celledødsrepressorer, Bcl-2 (B Cell Lymphoma-2)-familieproteiner på samme måde som i andre celletyper25. Desuden er sphingosin også en potent inhibitor af proteinkinase C (PKC), som har vist sig at beskytte celler mod apoptotisk celledød; følgelig kan sphingosin fremme apoptose gennem PKC-hæmning ved at ændre niveauet af Blc-2-fosforylering25. Desuden har mange undersøgelser også vist, at beta-adrenerge receptor1-blokker (β1-blokker) øger kardiomyocytternes modstandsdygtighed over for celledød ved at udvide overlevelsesområdet for Bcl-2’s switchingrespons26. Beta-adrenerge receptor1 er en af de β-adrenerge receptorer, der er kendt for at overføre celledødssignalet via cyklisk 3′,5′-adenosinmonofosfat (cAMP)-afhængige signalveje i kardiomyocytter, hvilket kan resultere i en reduktion af hjertets kontraktilitet i forbindelse med patofysiologien ved hjertesvigt26. Vi foreslår muligheden for, at vandekstrakterne af Pan cyanescens og P. cubensis-svampe kan indeholde forbindelser med potentiel evne til at fremme eller aktivere overekspression og/eller fosforylering af Blc-2-proteinveje og derved hæmme den inducerede apoptose og bevare mitokondriemembranintegriteten i de behandlede celler. Og dette stof/denne forbindelse(r) kan være mere udtalt(e) i koldtvandsudtrækket af Pan cyanescens-svampen.
Dertil kommer, at de undertrykkende virkninger af to-vandsekstrakten af P. cubensis og varmtvandsekstraktet af Pan cyanescens på ET-inducerede TNF-α-niveauer i behandlede celler indikerede også, at disse ekstrakter også kan have aktivitet på nuklearfaktor (NF)-κB-signalering, en transkriptionsfaktor, der regulerer ekspressionen af mange proinflammatoriske cytokiner, herunder TNF-α og de gener, der er forbundet med apoptose27. Undersøgelser har foreslået, at den inflammationsrelaterede NF-κB-signalering og dens korrelation med apoptose er den underliggende mekanisme i patogenesen for hjertesvigt28. Endvidere kan oxidativ stress også aktivere NF-κB og igangsætte transkriptionen af talrige proapoptotiske gener, herunder Bax, Fas og Fas-ligand, hvilket fremkalder myokardiecelleapoptose og yderligere fremmer hjertesvigt29. Det anbefales derfor at foretage en yderligere undersøgelse af virkningsmekanismerne in vitro og in vivo. Desuden er det i tidligere undersøgelser blevet bekræftet, at der findes mykokemiske forbindelser i både Pan cyanescens og P. cubensis-svampe, f.eks. alkaloider, med kendte biologiske aktiviteter, herunder toksicitet over for celler fra fremmede organismer22,30. Saponiner, der er kendt som potente antioxidanter, der neutraliserer frie radikaler, og flavonoider med antioxidant-, antiinflammatoriske og antikarcinogeniske aktiviteter22,30. Endelig blev der i de to svampe også påvist tanniner med antioxidante egenskaber i forbindelse med deres scavenging-aktiviteter, der er rapporteret at være blevet anvendt mod hjertesygdomme22,30. Tilstedeværelsen af disse forbindelser kan også have spillet en rolle i de beskyttende aktiviteter, som vandekstrakterne af Pan cyanescens og P. cubensis-svampe i undersøgelsen udviste. Undersøgelsen viste også, at de kardiobeskyttende virkninger generelt var mere udtalte med varmtvandsekstrakterne af de to svampe sammenlignet med koldtvandsekstrakterne, hvilket tyder på større fordele hos brugere af svampene, der indtager svampene sammen med te.
Sammenfattende viste undersøgelsen, at ET-1 signifikant øgede cellestørrelsesmålinger, BNP-, TNF-α- og ROS-niveauer og nedsatte mitokondriel aktivitet i de stimulerede kardiomyocytceller. Resultaterne viste, at vandekstrakterne af P. cubensis og Pan cyanescens svampe signifikant vendte cellestørrelsen og BNP-niveauerne, som er to indekser for hypertrofi, og øgede cellernes levedygtighed. De to vandekstrakter af P. cubensis og varmtvandsekstrakt af Pan cyanescens-svampe reducerede også signifikant det ET-1-inducerede TNF-α, et proinflammatorisk cytokin, der er involveret i udviklingen af patologisk hypertrofi og hjertesvigt. De fire ekstrakter hæmmer også de ET-1-inducerede intracellulære ROS-niveauer betydeligt, hvilket indikerer potentiel sikkerhed under disse forhold. Desuden udviste ekstrakterne beskyttende egenskaber mod TNF-α-induceret celleskade og celledød i de koncentrationer, der blev undersøgt i undersøgelsen.
Endeligt foreslog undersøgelsen, at vandekstrakterne af Panaeolus cyanescens og Psilocybe cubensis-svampe ikke øgede de ET-1-inducerede hypertrofiske ændringer, i stedet havde de to svampe kardiobeskyttende potentielle egenskaber og lindrede også mod TNF-α-induceret celleskade og celledød i de undersøgte koncentrationer. Undersøgelsen viste for første gang sikkerheden og de potentielle gavnlige egenskaber ved anvendelse af Panaeolus cyanescens og Psilocybe cubensis-svampe i forbindelse med hjertesvigt, hvor ET-1 er årsag til patologiske hypertrofiske forandringer. Der skal dog advares med højere koncentrationer. Der er behov for yderligere undersøgelser for at fastslå de underliggende virkningsmekanismer.