Abstract
Kombinationen af trombofili og graviditet øger risikoen for trombose og potentialet for negative resultater under graviditeten. Den mest betydningsfulde almindelige arvelige risikofaktor for trombofili er aktiveret protein C-resistens (APCR), et dårligt antikoagulerende svar fra APC i forbindelse med hæmostase, som hovedsagelig skyldes en arvelig enkeltnukleotidpolymorfi (SNP), faktor V G1691A (FV Leiden) (FVL), benævnt arvelig APCR. Ændringer i niveauerne af koagulationsfaktorer: FV, FVIII og FIX og antikoagulerende faktorer: protein S (PS) og protein C (PC) kan ændre APC-funktionen og forårsage erhvervet APCR. Prothrombin G20210A og methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR) C677T er protrombotiske SNP’er, som i forbindelse med APCR også kan øge risikoen for trombose blandt kaukasiere. I denne undersøgelse blev der påvist en korrelation mellem en erhvervet APCR-fænotype og forhøjede niveauer af faktor V, VIII og IX. Trombofile mutationer blandt vores erhvervede APCR-kohorte af gravide kvinder er relativt almindelige, men synes ikke at udøve en alvorlig unødig negativ virkning på graviditeten.
1. Indledning
Graviditet øger risikoen for trombose. APCR-fænotype er blevet associeret med venøs tromboembolisme (VTE), den primære årsag til maternel død i udviklede lande .
Under normale forhold inaktiverer APC det koagulerende protein aktivt FV(a) ved at kløve i en ordnet sekvens specifikke steder af FV(a). Det første spaltningssted er arginin (Arg) 506, og det andet er (Arg) 306 efterfulgt af (Arg) 679 . Mutationer i FV-genet er blevet sat i forbindelse med APCR. FVL er rapporteret hos ca. 90 % af patienter med APCR i den almindelige befolkning . Andre SNP’er i faktor V-genet, som kan bidrage til arvelig APCR enten uafhængigt af hinanden eller fundet i forbindelse med FVL-mutationen, omfatter Cambridge Arg306, Hong Kong, Arg306, Arg679 og haplotypen (H) R2- og R3-polymorfismen. Rapporterne om disse mutationers bidrag til APCR-fænotypen er imidlertid modstridende .
Den patofysiologi, der ligger til grund for APCR, som ikke er forårsaget af FVL-mutationen, er stadig ikke helt forstået. I forskellige undersøgelser er det blevet foreslået, at erhvervede faktorer kan være årsag til APCR i fravær af FV Leiden . En række koagulationsfaktorer kan påvirke den aktiverede partielle tromboplastintid (aPTT). Tidligere litteratur har antydet en mulig positiv korrelation mellem niveauerne af faktor V, VIII og IX og erhvervet APCR . Niveauerne af protein S og protein C kan (eller kan) påvirke den erhvervede APCR, men deres indflydelse på resistensen synes stadig at ligge inden for det normale niveau .
Andre kendte SNP’er, der er forbundet med trombofili og negative resultater under graviditeten, er prothrombin G20210A og MTHFR C677T .
Prothrombin G20210A er forbundet med en stigning i niveauet af protrombinprotein (FII) i plasma og en deraf følgende 3-dobbelt stigning i trombotiske hændelser. Prothrombin G20210A-mutationen synes at øge risikoen for trombose hos gravide kvinder med ca. ti gange, idet risikoen for at udvikle obstetriske komplikationer øges med fire gange .
MTHFR C677T er blevet forbundet med obstetriske komplikationer og med fødselsdefekter .
I en tidligere undersøgelse i dette laboratorium identificerede vi kendte og nye SNP’er i et lille antal personer med APCR bestemt ved hjælp af den modificerede Coatest-test, som ikke havde FVL-mutationen .
De vigtigste mål med denne undersøgelse var at (1) bestemme og sammenligne niveauerne af faktor V, VIII og IX i de erhvervede APCR-, arvelige APCR- og APCR-negative grupper, (2) sammenligne hyppigheden af negative resultater i de APCR-positive (erhvervede og arvede) og APCR-negative grupper, og (3) bestemme hyppigheden af negative graviditetsresultater, der er forbundet med andre trombofile mutationer end FVL-mutation i vores undersøgelseskohorte (𝑛=907). De negative graviditetsudfald, der blev observeret i denne undersøgelse, omfattede (tidligere) tilbagevendende tidligt graviditetstab (REPL), præeklampsi (PET) og intrauterin væksthæmning (IUGR). Graviditetsinduceret hypertension (PIH), (IUFD) intrauterin fosterdød, og lav fødselsvægt (LBW).
2. Materialer og metoder
2.1. Emner
Der blev indhentet etisk godkendelse af undersøgelsen fra den forskningsetiske komité, og der blev indhentet skriftligt samtykke til indsamling af prøver fra de 907 gravide kvinder, der indgik i denne undersøgelse, og som deltog i rutinemæssig ambulant svangerskabsscreening på den prænatale klinik på University College Hospital, Galway, (UCHG). Tabel 1 indeholder en detaljeret beskrivelse af undersøgelsespersonernes demografiske data.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SVD: Spontan vaginal fødsel; AV: Assisteret vaginal fødsel; CS: Kejsersnit. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Blodprøver (lithiumheparin og EDTA) blev indsamlet fra forsøgspersoner mellem den 16. og 24. svangerskabsuge. I dette andet trimester af graviditeten er der påvist ringe eller næsten ingen variation i koagulationsfaktorerne, hvilket er hensigtsmæssigt for vurderingen af APC-status . Testning af APC-status før eller fra 8 til 12 uger efter graviditeten eller hyppigere i løbet af graviditeten ville have bestemt et mere præcist stabilt APC-forhold; dette er en begrænsning i den aktuelle undersøgelse. Laboratorieanalysen af dårligt antikoagulerende respons på APC er baseret på en analyse af aktiveret delvis tromboplastintid (aPTT). Et reduceret forhold afspejler den reducerede inaktiveringshastighed. Det cutoff-forhold, der blev anvendt til at bestemme positiv APCR i denne undersøgelse, var en værdi på mindre end eller lig med 2,1 sekunder (s). Denne værdi blev fastsat af hæmatologisk afdeling, og den er i klinisk brug på UCHG. Det cut-off-forhold, der anvendes til bestemmelse af APCR, kan variere i følsomhed og specificitet afhængigt af den metodologi, det udstyr og den teknologi, der anvendes i forskellige laboratorier.
2.2. APC-status ved klassisk Coatest-test med henblik på at identificere erhvervede APCR-prøver
Blodprøver blev centrifugeret ved 4.000 rpm i 5 minutter, og alikvotes af trombocytfattigt plasma blev frosset ned ved -80 °C, indtil analysen fandt sted. Plasma blev inkuberet med et lige stort volumen aPTT-reagens i 5 min. ved 37 °C. Koagulationen blev indledt ved tilsætning af CaCl2, og koagulationstiden blev udtrykt som forholdet mellem koagulationstiden i tilstedeværelse af APC divideret med koagulationstiden i fravær af APC.
2.3. APC-status ved modificeret Coatest-test med henblik på at identificere arvelige APCR-prøver
Blodprøver blev først fortyndet 1 til 5 med faktor V-deficient plasma, der indeholder en heparinneutralisator, og derefter blev det analyseret som beskrevet for den klassiske Coatest-test for APCR. Tilsætningen af faktor V-deficient plasma korrigerer for mangel på andre koagulationsproteiner, neutraliserer terapeutiske koncentrationer af heparin og eliminerer virkningen af nogle lupusinhibitorer . APCR i tilstedeværelse af faktor V-depleteret plasma blev vurderet ved hjælp af Coatest APCR-kit og faktor V-depleteret plasma (Chromogenix) .
2.4. DNA-ekstraktion
DNA blev ekstraheret fra blodprøver for alle APCR-emner (𝑛=140) og kontrolprøver (negativ APCR 𝑛=31) ved hjælp af en modifikation af CF(12)m-PCR-protokollen fra Ortho-Clinical Diagnostics, Amersham, UK. Spektrofotometrisk analyse af absorbansen ved 260 nm blev udført i et Heλios α-spektrofotometer (Unicam Ltd., England) for hver DNA-prøve, og det gennemsnitlige udbytte af DNA blev bestemt til 30 ng/μL.
2,5. Mutationsscreening
PCR-restriktionsenzymanalyse (PCR-REA) blev anvendt til at identificere G20210A i FII-genet, C677T i MTHFR-genet og FVL-, FV Cambridge-, FV Hong Kong-mutationer og Haplotype (H) R2, allel i FV-genet ved hjælp af modifikationer af tidligere offentliggjorte metoder . Der blev anvendt DNA-sondehybridiseringsanalyse og/eller DNA-sekventering til påvisning af Arg679 som beskrevet . 140 APCR-positive personer og 31 APCR-negative personer blev testet for alle mutationer. Vores gruppe af kontrolpersoner, der blev testet for trombofile mutationer, 𝑛=31, blev udvalgt tilfældigt ud af de 767 negative APCR-personer, der blev identificeret som normale med den klassiske APCR Coatest-test. Der blev identificeret et gennemsnit på 2,59 og en standardafvigelse på 0,2804 for denne negative APCR-gruppe på 𝑛=767 personer. Omvendt blev der identificeret et gennemsnit på 1,745 og en standardafvigelse på 0,1104 for den positive APCR-gruppe (arvet plus erhvervet) 𝑛=140. Den minimumsværdi, der blev identificeret for negativ APCR, var 2,160, mens den for positiv APCR var 1,490. Den maksimale negative APCR-værdi, der blev identificeret, var 3,030, mens den for positiv APCR var 2,060 sekunder. Trombofile mutationer forstyrrer koagulationsligevægten, idet de varierer aPTT-tiden i forhold til APC-forholdet.
Alle mutationer blev screenet i to eksemplarer, og positive kontroller bestående af DNA fra heterozygote og homozygote individer for FVL- og MTHFR-C677T-mutationer og heterozygote individer for andre undersøgte mutationer blev inkluderet, hvor det var tilgængeligt. En negativ kontrol, der bestod af vand i stedet for DNA-template, blev medtaget i hver PCR-kørsel. PCR-amplifikationen blev udført på GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer, USA).
2.6. DNA-sekventering til verifikation af identificerede mutationer
DNA-sekventering af 50 % af PCR-produkterne fra forsøgspersoner, der er screenet for Arg679-mutationen, blev udført for at verificere den normale genotype, der blev opnået ved Southern Blot-DNA-sondehybridiseringsanalyse for disse forsøgspersoner. PCR-produkterne på 400 bp fra Exon 13, der indeholder Arg679-stedet i FV-genet, blev oprenset ved hjælp af QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Ltd, UK) i henhold til producentens anvisninger og sendt til DNA-sekventering til en ekstern sekvenseringstjenesteudbyder (MWG Biotech, Tyskland). En prøve, der var positiv for Cambridge-mutationen ved PCR/REA-analyse, blev også oprenset ved hjælp af QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Ltd, UK) og sendt til sekventering for at bekræfte Arg306-mutationen.
2.7. Niveauer af faktor V, VIII og IX
Niveauerne blev bestemt for de APCR-positive og APCR-negative grupper ved hjælp af et et et-trins APTT-assay på et MDA 180-koagulometer (Organon Teknika, Cambridge, UK), idet der blev anvendt plasma med mangel på faktor V, VIII og IX (Diagnostica Stago). Den APCR-negative gruppe bestod af 50 kvinder udvalgt tilfældigt fra forskellige batchkørsler af Coatest-test, der danner grundlag for kontrolgruppen ved sammenligning af data mellem forskellige variabler.
Resultater for faktor V-, VIII- og IX-niveauer blev udtrykt som procentvise (%) niveauer, og de anvendte referenceintervaller er i øjeblikket i klinisk brug på hæmatologisk laboratorium, UCHG. Hver kørsel blev kontrolleret ved brug af en normal (MDA verify 1, Biomerieux) og en unormal kontrol (koagulationskontrol A, Technoclone GmbH).
2.8. Statistisk analyse af uønskede graviditetsudfald i den gruppe, der blev observeret i de 907 kvinder, der indgik i undersøgelsen
Data blev indsamlet fra barselsafdelingen på UCHG. Antallet og typen af de undersøgte graviditetsudfald blev analyseret ved hjælp af SPSS version 17.0 software. Pearson Chi Square-testen blev anvendt til at sammenligne den APCR-positive gruppe og den negative APCR-gruppe for at analysere de trombofile mutationer og rækkevidden af negative udfald forbundet med hver gruppe. Pearson Chi-Square-testen blev anvendt til at sammenligne antallet og typen af uønskede graviditetsudfald i arvelige versus erhvervede APCR-grupper. SPSS blev anvendt til at analysere niveauerne af koagulationsfaktor V, VIII og IX ved hjælp af Kruskal-Wallis statistisk test.
2,9. Kriterier for uheldige resultater Diagnose
PET-BP (blodtryk) ≥140/90 mmHg, +1 proteinuri og ødem. PIH-BP ≥140/90 uden proteinuri i overensstemmelse med Official Journal of the International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy. IUGR er defineret som en fostervækst på mindre end 5. percentil for gestationsalder . LBW er defineret som en vægt på mindre end 2500 g (op til og med 2499 g), uanset gestationsalder.
3. Resultater
Vi identificerede 15,4 % (𝑛=140) af undersøgelseskohorten (𝑛=907) som APCR-positive med erhvervede og/eller nedarvede Coatest-tests. Faktor V-, VIII- og IX-niveauerne viste en positiv korrelation med en erhvervet APCR-fænotype. Niveauerne for hver faktor i de APCR-positive (arvede) og APCR-positive (erhvervede) og APCR-negative grupper er vist i tabel 2 og figur 1. Niveauerne af faktor V, VIII og IX i den erhvervede APCR-gruppe var signifikant højere sammenlignet med den normale kontrolgruppe. Middelværdierne var faktor V 131,5 IU/dL mod 114,6 IU/dL for kontrolgruppen, faktor VIII 128,7 IU/dL mod 111,9 IU/dL i kontrolgruppen og faktor IX 114,8 IU/dL mod 106,9 IU/dL i kontrolgruppen.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
(a) Graf, der sammenligner FV-niveauerne i forskellige grupper inden for undersøgelsen, (b) graf med sammenligning af FVIII-niveauer i forskellige grupper inden for undersøgelsen og (c) graf med sammenligning af F IX-niveauer i forskellige grupper inden for undersøgelsen.
22 personer (66 %) i den positive APCR-gruppe havde almindelige trombofile mutationer, hvoraf 32 % havde FVL-mutationen. I alt 𝑛=116 mutationer blev identificeret i denne gruppe, 68 forsøgspersoner havde én mutation, 23 havde to mutationer, 1 forsøgsperson havde tre mutationer, og 48 forsøgspersoner havde ingen af de kendte mutationer, der blev screenet for.
I den erhvervede (uden FVL) positive APCR (𝑛=105) var 70 mutationer fordelt på 61 forsøgspersoner, som havde en eller flere af disse mutationer. Inden for den negative APCR-gruppe (𝑛=31) havde 18 forsøgspersoner en mutation. Fordelingen af trombofile mutationer er opsummeret i tabel 3.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| (*1) 𝑛=140 er personer med total APCR (erhvervet +modificeret). (*2) 𝑛=105 er personer med erhvervet APCR, uden arvelig FVL. (*3) 𝑛=31 er negative APCR-emner, der er testet ud af 767. 𝑛: Antal forsøgspersoner; ht: Heterozygoter; hom: Homozygoter; H: Haplotype. Folk identificeret med mere end én mutation samtidig: I den samlede APCR-gruppe (nedarvet plus erhvervet) var der 13 forsøgspersoner med MTHFR+FVL; 1 forsøgsperson med MTHFR + FVL + Cambridge; 7 forsøgspersoner med MTHFR + HR2; 1 forsøgsperson med prothrombin G20210A + HR2; og 1 forsøgsperson med protrombin G20210A + MTHFR; i den erhvervede APCR-gruppe havde de 7 forsøgspersoner med MTHFR + HR2; 1 forsøgsperson med protrombin G20210A + HR2; 1 forsøgsperson med protrombin G20210A + MTHFR. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Frekvenserne af negative resultater i positive APCR- og negative APCR-grupper var meget ens med henholdsvis 35,7 % og 34,2 % (tabel 4). Sammenligningen af uønskede graviditetsudfald og trombofile mutationer er opsummeret i tabel 5. PIH viste statistisk signifikant (𝑃<0,05) sammenhæng med Cambridge og prothrombin G20210A. LBW viste statistisk signifikant (𝑃<0,05) sammenhæng med HR2 og MTHFR.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NA: Der er ikke beregnet nogen statistik, fordi der ikke er IUGR i MTHFR- og HR2-grupperne. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Diskussion
Hyppigheden af APCR er blevet rapporteret som ca. 5% i den generelle kaukasiske befolkning . Den varierer fra 1 % til 15 % i forskellige lande med en hyppighed på 3 % rapporteret i Italien og Spanien og en hyppighed på 15 % rapporteret i Nordsverige . APCR i den almindelige befolkning og under graviditet rapporteres hyppigst at være forårsaget af FVL-mutation , arvelig APCR .
Flere rapporter har imidlertid vist, at mellem 5 og 10 % af APCR hos kaukasiere ikke involverer FVL, og årsagen til positiv APCR i disse tilfælde er ukendt . I vores undersøgelseskohorte (𝑛=907) var hyppigheden af erhvervet APCR, bestemt ved den klassiske Coatest-testmetode, på 11,5 %, væsentligt højere end hyppigheden af arvelig APCR identificeret ved modificerede Coatest-test, 3,9 %. De Visser et al. påviste, at en ændret APCR i fravær af FVL giver en 2,5 gange øget risiko for venøs trombose .
I denne undersøgelse blev der påvist en signifikant statistisk korrelation mellem den erhvervede APCR-fænotype og faktor V-, VIII- og IX-niveauerne. Yderligere undersøgelse ville være nødvendig for at bestemme interaktionen af koagulationsfaktorer for yderligere at karakterisere denne erhvervede APCR-fænotype i tidlig graviditet. Erhvervet APCR kan være resultatet af en kompleks række af reaktioner, der giver en defekt APC-medieret nedbrydning af disse koagulationsfaktorer. Til gengæld kan en stigning i disse koagulationsfaktorer i de tidlige graviditetsfaser forårsage en ubalance i koagulationskaskaden og føre til vaskulære og endothelskader under implantation og placentation. Dette har potentiale til at forårsage placentainfarkter og høje niveauer af fibrinaflejring, som tidligere er blevet associeret med APCR . Spontan abort kan finde sted som reaktion på en øget ubalance i koagulationen, og hvis der er andre trombotiske faktorer, herunder trombofile mutationer, der interagerer samtidig, når forsøgspersonen er ud over den 20. graviditetsuge, kan skaden udvikle sig til PET eller PIH.
Mutationer i FV-genet, undtagen FVL, især på de andre spaltningssteder for FV, Arg306 og Arg679, har potentiale til at bidrage til APCR-fænototypen . Haplotype (H) R2 er også blevet associeret med mild APCR, når den findes i kombination med FVL . Der er blevet identificeret en række andre mutationer i FV-genet; det er dog nødvendigt at undersøge en større gravid population for at afgøre, om disse mutationer bidrager væsentligt til APCR i de kaukasiske populationer . Trombofili under graviditet er blevet forbundet med andre mutationer end dem, der findes i FV-genet, herunder prothrombin G20210A og MTHFR-C677T . I denne undersøgelse identificerede vi trombofile mutationer i 66 % af vores positive APCR-gruppe (erhvervet plus arvet) (𝑛=140) . En af disse personer havde 2 mutationer i FV-genet, FVL og FV Cambridge-G1091C, på to spaltningssteder af FV for APC . Denne person blev også fundet i denne undersøgelse at være bærer af MTHFR-C677T-mutationen. Tidligere undersøgelser har vist, at tilstedeværelsen af mere end én prothrombotisk polymorfi er forbundet med en betydelig risiko for VTE med en høj risiko for negative graviditetsresultater . Desuden er MTHFR-C677T-mutationen for nylig blevet inddraget i præeklampsi. Den høje frekvens af MTHFR-C677T i de negative APCR- og positive APCR-grupper kan ligge til grund for befolkningsspecifikke forskelle . Forskelle i de negative graviditetsresultater, der er forbundet med MTHFR-C677T, kan forklares ved de specifikke frekvensforskelle mellem befolkningsgrupper .
Vi identificerede også prothrombin G20210A hos 3 personer i den erhvervede APCR-gruppe uden tilstedeværelse af FVL-mutation, med (H) HR2 haplotypen og MTHFR-C677T identificeret i både positive APCR (erhvervet plus nedarvet) og negative APCR-grupper.
De negative APCR-prøver (𝑛=31), der blev testet for trombofile mutationer i denne undersøgelse for at repræsentere den normale kohorte, er et lille prøveantal, og dette kan være en fejl i vores undersøgelse, der resulterer i ikke-signifikante forskelle. Testning af et større antal negative APCR ville have givet mere sikre resultater. Dette kan være noget, der skal undersøges i en fremtidig undersøgelse.
Mens nogle tidligere undersøgelser har vist en sammenhæng mellem positiv APCR og PET, IUGR og IUFD, var der i denne undersøgelse ingen signifikant forskel i hyppigheden af negative resultater mellem positive APCR- og negative APCR-grupper. Dette synes at være i overensstemmelse med andre tidligere undersøgelser . Ikke desto mindre gør den samlede hyppighed af negative graviditetsudfald i den positive APCR-gruppe denne undersøgelsesgruppe til “en højrisikogruppe”. Miljømæssige faktorer såsom rygning og body mass index (BMI), som kunne have påvirket antallet af erhvervede APCR og hyppigheden af de identificerede negative resultater, blev ikke medtaget. Dette er en begrænsning af undersøgelsen.
I vores samlede undersøgelsesgruppe synes trombofile mutationer, herunder FVL Cambridge og Prothrombin G20210A, at være relateret til PIH, mens MTHFR-C677T og HR2 haplotype syntes at være forbundet med LBW. Selv om positiv APCR i sig selv ikke synes at være årsag til alvorlige negative resultater under graviditeten, kan arvelig APCR ikke desto mindre have en effekt på hypertension, når den er til stede i kombination med andre kendte og ukendte trombofile risikofaktorer, der virker samtidig under graviditeten.
Anerkendelser
Dette arbejde blev støttet af det irske sundhedsforskningsråd (Irish Health Research Board). Forfatterne er taknemmelige over for de gravide kvinder, der indvilligede i at deltage i undersøgelsen, og jordemødrene fra fødeafdelingen på UCHG. Forfatterne ønsker at takke Benoit Houeix for hans bidrag til den statistiske analyse, der er medtaget i denne artikel, og også Dr. D. Mongan, UCH, Galway, for hendes samarbejde med hensyn til at tilvejebringe oplysninger om negative resultater og dataanalyse af de personer, der indgik i undersøgelsen.