Fosforylering regulerer CAP1 (Cyclase-Associated Protein 1) funktioner i motilitet og invasion af bugspytkirtelkræftceller

Ingen opregulering af CAP1, men forhøjet S308/S310-fosforylering, blev påvist i bugspytkirtelkræftceller

CAP1-proteinniveauer blev bestemt i Western Blotting i et panel af almindeligt anvendte bugspytkirtelkræftcellelinjer {PANC-126, CFPAC-127, AsPC-128 og Mia PaCa-229} og sammenlignet med niveauet i den immortaliserede, men utransformerede bugspytkirtelcellelinje hTERT-HPNE30, der tjener som kontrol. Som vist i Fig. 1A udtrykker alle fire kræftcellelinjer rigelige niveauer af CAP1, der er sammenlignelige med niveauet i HeLa-celler, som vi tidligere har rapporteret, at de udtrykker rigelige niveauer af både CAP1 og CAP212. Vi fandt, at de utransformerede hTERT-HPNE-celler udtrykte sammenlignelige niveauer af CAP1 med dem i kræftcellelinjerne. Vi undersøgte også ekspressionsniveauerne for den anden CAP-isoform, CAP2, og fandt, at PANC-1- og Mia PaCa-2-cellerne havde betydeligt opreguleret CAP2-ekspression sammenlignet med ekspressionen i hTERT-HPNE-cellerne (Fig. 1A).

Vi har tidligere rapporteret, at GSK3 fosforylerer S309 på mus CAP124 (svarende til S310 på human CAP1; justerede sekvenser vist i Fig. 1B). I betragtning af den rapporterede hyperaktivering af GSK3 i bugspytkirtelkræft25 undersøgte vi den potentielle forhøjelse af S308/S310-fosforylering på CAP1 i kræftceller ved hjælp af et fosfor-specifikt antistof, der genkender fosfor-signaler på begge serinrester i Western Blotting24. Interessant nok var S308/310-fosforylering signifikant forhøjet i kræftcellerne sammenlignet med kontrolcellerne (Fig. 1B, vist med kvantificerede data kun for PANC-1- og CFPAC-1-cellelinjerne, men lignende resultater blev opnået med AsPC-1- og Mia PaCa-2-celler). Dernæst inhiberede vi GSK3 ved at behandle kræftceller med en potent GSK3-hæmmer 6-BIO (6-bromoindirubin-3′-oxim)31 og fandt, at behandlingen reducerede S308/S310-fosforylering på CAP1 i PANC-1- og CFPAC-1-celler på en dosisafhængig måde (Fig. 1C, vist kun for PANC-1-celler). Behandling med 6-BIO reducerede også CAP1-fosforylering i kontrolpancreascellerne. Tilsvarende reducerede en mere selektiv GSK3-inhibitor, LiCl32, også CAP1-fosforylering i PANC-1- og AsPC-1-celler, som vist senere. Disse resultater understøtter, at GSK3 også er en del af fosforyleringsmaskineriet for CAP1 ved S308/S310 i bugspytkirtelkræftceller. Det bemærkes også, at behandling af kræftceller og kontrolceller med 6-BIO konsekvent førte til mærkbar opregulering af CAP1 gennem en ukendt mekanisme.

Knockdown af CAP1 førte til forbedrede stressfibre samt reduceret motilitet og invasion af kræftceller

Vi forsøgte dernæst at lukke CAP1 ned for at bestemme CAP1’s roller i bugspytkirtelkræftceller. Det stabile knockdown-paradigme, som vi tidligere har udviklet, er kompatibelt med en redningsstrategi, som gør det muligt at verificere specificiteten af afledte fænotyper fra depletion af CAP112,18,24. Ved hjælp af to shRNA-konstruktioner S2 og S3, der er målrettet mod uafhængige nukleotidsekvenser og effektivt har gjort CAP1 tavs i HeLa- og brystkræftceller12,18,24,33, var vi i stand til at generere stabile kloner med effektiv CAP1 knockdown i PANC-1- og AsPC-1-cellerne, hvilket blev bekræftet i Western Blotting (Fig. 2A). To stabile knockdown-kloner, hver afledt af PANC-1 (S2-1 og S3-3) og AsPC-1 (S2-3 og S2-7), blev etableret henholdsvis gennem neomycin-selektion. Det er dog bemærkelsesværdigt, at forsøg på at lukke CAP1 ned i CFPAC-1 og Mia PaCa-2 kræftcellelinjerne ikke lykkedes. CFPAC-1-cellerne formede ikke kolonier efter antibiotikaudvælgelse, mens ingen af de ca. to dusin stabile kolonier, der blev screenet, havde en væsentlig reduktion af CAP1-ekspressionen i Mia PaCa-2-cellerne (data ikke vist).

Vi undersøgte først morfologiske og aktincytoskeletale ændringer i CAP1-knockdown PANC-1- og AsPC-1-cellerne. I modsætning til den øgede cellestørrelse i CAP1-knockdown HeLa-celler og metastaserende brystkræftceller12,18,24 forårsagede depletion af CAP1 ikke nogen mærkbar stigning i størrelsen af PANC-1- eller AsPC-1-celler. Vi farvede derefter actincytoskelettet i PANC-1-cellerne med Phalloidin, efterfulgt af fluorescerende mikroskopi. PANC-1-celler (og bugspytkirtelkræftceller generelt) synes at have dårligt organiserede aktincytoskeletstrukturer, især med hensyn til stressfibrene (Fig. 2B), i forhold til de cellelinjer, der almindeligvis anvendes til aktincytoskeletundersøgelser, såsom HeLa og NIH3T3 fibroblaster12,24. Ikke desto mindre var der tydelige forbedrede stressfibre i de CAP1-knockdown PANC-1-celler sammenlignet med kontrolcellerne (Fig. 2B). Alle 26 kontrolceller, der har en tom vektor, der blev undersøgt, viste meget begrænset tilstedeværelse af stressfibre. I modsætning hertil havde 20 ud af 27 (74,1 %) af S2-1 og 18 ud af 23 (78,3 %) af S3-3 CAP1-knockdown-cellerne, der blev undersøgt, bemærkelsesværdigt udviklede stressfibre, svarende til det, der er vist i Fig. 2B. Akkumulation af stressfibre er konsekvent blevet observeret i andre celler med CAP1-depletion12,13, en fænotype, der menes at være afledt af tabet af både CAP1-funktioner til at seponere actin-monomerer og til at fremme actinfilamentomsætning.

Konsistent med de øgede stressfibre er depletion af CAP1 blevet rapporteret til at reducere motilitet i en række pattedyrcelletyper, herunder cancerceller13,14,17,18,19. Transient knockdown af CAP1 i bugspytkirtelkræftceller viste sig også at reducere cellens motilitet i sårhelingsforsøg14. Vi testede effekten af stabil CAP1 knockdown på invasivitet af bugspytkirtelkræftceller ved at udføre sårhelingsassays, Transwell-migrationsassays samt Matrigel-invasionsassays. Depletion af CAP1 reducerede væsentligt cellemobiliteten i sårhelingssassays for både PANC-1- og AsPC-1-celler (Fig. 2C), hvilket er i overensstemmelse med de tidligere rapporterede resultater14. Sårene i CAP1-knockdown PANC-1-cellerne (både S3-3 og S2-1) helede kun marginalt 24 timer efter indførelsen, mens hullet i kontrolcellerne næsten var blevet fyldt helt op. Lignende virkninger blev observeret i de stabile CAP1-knockdown AsPC-1-kloner S2-3 og S2-7 (Fig. 2C). Resultaterne fra Transwell-migrationsassays af PANC-1-celler var i overensstemmelse med resultaterne fra sårhelingsassays, som det fremgår af grafen med kvantificerede resultater i det nederste panel (Fig. 2C). Desuden viser invasionsassaysene, at depletion af CAP1 også reducerede PANC-1 kræftcellers evne til at trænge ind og invadere gennem Matrigel (Fig. 2D). Student’s t-test-analyser af data indsamlet fra tre uafhængige assays afslører signifikant reduceret invasion i de stabile PANC-1-celler med CAP1-knockdown (Fig. 2D). Endelig, da EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition) er relateret til kræftcellers invasivitet, testede vi den potentielle effekt af CAP1-nockdown på EMT. Faktisk havde CAP1-knockdown PANC-1-cellerne opreguleret E-Cadherin, hvilket indikerer reduceret EMT (fig. 2E). Vi testede også en anden EMT-markør, Vimentin, og fandt, at udtynding af CAP1 reducerede dens ekspression (Fig. 2E). Tilsammen understøtter disse resultater en nødvendig rolle for CAP1 i invasivitet og EMT i PANC-1 kræftcellerne.

Hæmning af GSK3, som undertrykker CAP1-fosforylering, reducerede motilitet og invasion af kræftceller

Vores tidligere resultater tyder på, at forbigående fosforylering er afgørende for CAP1-funktionen i reguleringen af aktincytoskelettet24. Den forhøjede CAP1-fosforylering i bugspytkirtelkræftceller, der stemmer overens med den aktiverede GSK3, tyder på, at fosforregulering også kan spille en rolle for CAP1-funktionen i kræftcellers invasivitet. Vi testede denne mulighed ved at hæmme GSK3, som undertrykker S308/S310-fosforylering og i mellemtiden forstyrrer CAP1-regulering gennem forbigående fosforylering på det regulatoriske sted. PANC-1-celler blev behandlet med 6-BIO efterfulgt af cellemigration og invasionsassays. Virkningerne af den reducerede S308/S310-fosforylering på CAP1 ved behandling med 5 μM 6-BIO (fig. 1C) blev først testet. Som vist i Fig. 3A reducerede 6-BIO-behandling signifikant motiliteten af PANC-1-celler i både sårheling og Transwell-migrationsassays. Vi bekræftede også, at behandling af PANC-1- og AsPC-1-celler med en anden GSK3-hæmmer, LiCl, reducerede CAP1-fosforylering såvel som cellemotilitet i sårhæringsassays (Fig. 3A,B). Endvidere reducerede 6-BIO-behandling også Matrigel-invasionen af PANC-1-celler (Fig. 3C). Endelig, da GSK3 er kendt for at regulere en lang række cellefunktioner gennem et væld af substratmolekyler, er effekten af GSK3-hæmning på cellemotilitet sandsynligvis et kollektivt output gennem flere GSK3-mål, der er involveret i reguleringen af cytoskelettet, cellepolarisering og migration34,35. Vi testede og sammenlignede således virkningerne af 6-BIO med hensyn til at reducere cellemotilitet i CAP1-knockdown PANC-1-celler og kontrolceller. Som vist i grafen i Fig. 3D reducerede 6-BIO-behandling signifikant motiliteten af kontrolcellerne (Vec), men ikke motiliteten af CAP1-knockdown-cellerne (S2-1 og S3-3) i sårhelingsassaysene. Samlet set understøtter disse resultater, at fosforregulering gennem S308/S310 spiller en vigtig rolle for CAP1 til at fremme motilitet og invasion i bugspytkirtelkræftceller.

Phosphormutanter af CAP1 havde kompromitterede funktioner med hensyn til at afhjælpe de forbedrede stressfibre og fremme udviklingen af lamellipodier i CAP1-knockdown PANC-1-cellerne

Vores resultater fra CAP1-knockdown-cellerne understøtter, at CAP1 er påkrævet for kræftcellers motilitet og invasion, og resultaterne fra GSK3-hæmning tyder på, at S308/S310-fosforylering spiller en nøglerolle i CAP1-funktionerne. Herefter anvendte vi en reekspressionsstrategi for yderligere at fastslå disse tilfælde. Wild type CAP1 (WTCAP1) og fosformutanterne, der efterligner enten fosforylerede (S307D/S309D; DD) eller ikke-fosforylerbare (S307A/S309A; AA) former af CAP1, som tidligere beskrevet12,18,24, blev stabilt reeksprimeret i CAP1-knockdown PANC-1-cellerne for at teste deres evne til at redde aktincytoskeletale og cellemorfologiske fænotyper. Disse mutanter har mismatches til S3 shRNA-målsekvensen for at undgå genkendelse af de afledte mRNA’er af det shRNA, der er stabilt til stede i knockdown-cellerne, men uden ændring af nogen aminosyre på CAP112. Vi var i stand til at etablere stabile kloner, der genudtrykker WT-mus CAP1 eller AA- og DD-fosformutanten, hvilket blev bekræftet i Western Blotting mod 6xHis-tagget (Fig. 4A). Bemærk, at to irrelevante baner var blevet fjernet fra det oprindelige Western Blot-billede (prøver i disse to baner blev brugt til at bekræfte reekspression af to serin 36 fosformutanter ved N-terminus). Hele sættet af det oprindelige Western blot-resultat er vist i supplerende figur 1. Morfologien af celler, der genudtrykker enten AA- (AA-R) eller DD- (DD-R) mutanten, blev undersøgt i fasemikroskopi og sammenlignet med morfologien i celler, der genudtrykker WTCAP1 (WT-R). Det er blevet rapporteret, at knockdown af CAP1 i nogle pattedyrcelletyper, herunder HeLa-celler og metastaserende brystkræftceller, førte til signifikant øget cellestørrelse12,13,18, en fænotype, som vi tidligere har bekræftet var specifik for knockdown af CAP112,18. CAP1-knockdown i PANC-1-celler eller AsPC-1-celler viste imidlertid ikke denne effekt. I stedet øgede stabil reekspression af WTCAP1 eller fosformutanterne i knockdown-cellerne faktisk cellestørrelsen betydeligt (fig. 4B). Desuden førte reekspression af WTCAP1 til udvikling af lamellipodier af robust størrelse (angivet med pile), en subcellulær struktur, der er rig på filamentøst aktin og er kritisk for at drive retningsbestemt cellebevægelse (Fig. 4C), hvorimod stort set ingen af de knockdown-celler, der havde en tom kontrolvektor, udviklede sådanne lamellipodier. Genudtrykt AA- eller DD-mutant stimulerede også dannelsen af lamellipodier i et vist omfang, men deres størrelse var mærkbart mindre sammenlignet med den i cellerne, der genudtrykte WTCAP1 (angivet med pile i Fig. 4C). Vi talte 200 celler for hver celletype, og procentdelene af celler, der huser lamellipodier af stor størrelse, var: 0% (0/200) for knockdown-cellerne (Vec), 14,5% (29/200) for WT-R-cellerne og 9% (18/200) og 7,5% (15/200) for henholdsvis AA-R- og DD-R-cellerne.

Vi undersøgte dernæst fosformutanternes evne til at afhjælpe de forbedrede stressfibre i CAP1-knockdown PANC-1-cellerne. Som det fremgår af de konfokale billeder i Fig. 4D, lindrede reekspression af WTCAP1 (WT-R) effektivt de forbedrede stressfibre, hvorved fænotypen blev reddet, og stressfibrene blev opløst i store områder angivet med en pil. I modsætning hertil var fosformutanterne mindre effektive til at afhjælpe de forstærkede stressfibre. Celler, der genudtrykker AA-mutanten, havde beskedent forstærkede stressfibre end de celler, der blev reddet af WTCAP1, mens cellerne, der genudtrykker DD-mutanten, syntes at have endnu mere forstærkede stressfibre. Disse resultater er i overensstemmelse med vores tidligere resultater fra HeLa-celler, der tyder på, at affosforyleret CAP1 er den “aktive” form i forhold til fosforyleret CAP124, mens forbigående fosforylering menes at være påkrævet for optimale cellulære funktioner af CAP1. Disse resultater tyder også på, at forbigående S308/S310-fosforylering er vigtig for, at CAP1 kan regulere aktincytoskelettet i bugspytkirtelkræftceller; forstyrrelse af reguleringen gennem forbigående fosforylering fører til defekter i CAP1-funktionen med hensyn til at fremme actinfilamentomsætningen.

CAP1 fosformutanter havde defekter, der reddede den reducerede invasivitet i CAP1-knockdown kræftceller

Da dynamisk actinfilamentomsætning er den primære drivkraft for cellebevægelse, testede vi derefter, hvor godt fosformutanterne redder den reducerede cellemotilitet og invasion i CAP1-knockdown PANC-1 cellerne. Vi udførte først Transwell-migrationsassays og fandt, at reekspression af WTCAP1 signifikant øgede cellemotiliteten sammenlignet med kontrolcellerne, der har en tom vektor, som vist i kvantificerede resultater i grafen (Fig. 5A). Den reeksprimerede AA-mutant (AA-R), selv om den ikke var lige så effektiv som WTCAP1, reddede delvist den reducerede cellemotilitet i Transwell-migrationsassays. I modsætning hertil lykkedes det ikke DD-mutanten (DD-R) at redde den reducerede cellemotilitet, og hastigheden var sammenlignelig med den i CAP1-knockdown-cellerne med en tom vektor. Disse resultater er i overensstemmelse med mulighederne for at redde de forbedrede stressfibre ved WTCAP1 og fosformutanterne. Vi testede yderligere redning af den reducerede Matrigel-invasion i CAP1-knockdown-cellerne, som vist i de kvantificerede resultater i Fig. 5B. På samme måde reddede WTCAP1 den reducerede invasion i CAP1-knockdown PANC-1-cellerne mest effektivt; AA-mutanten opnåede en delvis redning, mens DD-mutanten bogstaveligt talt ikke kunne redde fænotypen. Endelig reducerede reekspression af WTCAP1 i CAP1-knockdown-cellerne også E-Cadherin-ekspressionen (Fig. 5C), hvilket yderligere understøtter, at CAP1 er nødvendig for EMT i PANC-1 kræftceller. Tilsammen understøtter disse resultater, at fosforregulering gennem S308/S310-tandemstedet spiller en vigtig rolle for CAP1 for at fremme motilitet og invasion af bugspytkirtelkræftceller.

Evidens, der understøtter, at CAP1 medierer ekstracellulære vækstfaktorsignaler for at kontrollere kræftcellers invasivitet

Fysiologiske stimuli, såsom vækstfaktorerne PDGF og HGF (Hepatocytvækstfaktor)36, er kendt for at stimulere omlægning af aktincytoskelettet og cellevandring. Da fosforregulering ved S308/S310 er afgørende for CAP1-funktioner i forbindelse med regulering af aktincytoskelettet og kræftcellers invasivitet, undersøgte vi muligheden for, at disse stimuli kan regulere CAP1-fosforylering og derigennem kontrollere aktincytoskeletets omlægning og kræftcellers invasivitet. Interessant nok reducerede behandling af serumshærgede PANC-1- og AsPC-1-celler med PDGF S308/S310-fosforylering på CAP1, mest bemærkelsesværdigt på 5-minutterstidspunktet (Fig. 6A,B). Behandling af bugspytkirtelkræftceller med HGF eller serum havde ikke nogen betydelig effekt med hensyn til at inducere defosforylering af CAP1 (Supplerende fig. 2; vist for PANC-1-celler). Derfor er signalering gennem CAP1 sandsynligvis i det mindste delvist ansvarlig for, at PDGF stimulerer actincytoskeletets reorganisering og kræftcellers invasivitet. Disse resultater er også i overensstemmelse med forestillingen om, at affosforyleret CAP1 er den “aktive” form, hvilket antydes af flere beviser, herunder cofilinbinding, subcellulær lokalisering af fosformutanterne og forhøjet fosforylering af CAP1 i celler, der dyrkes i suspension24. Det antages imidlertid, at forbigående fosforylering på det tandemregulerende sted, nemlig cyklingen mellem den fosforylerede og den affosforylerede form, er nødvendig for optimale cellulære funktioner af CAP124. CAP1-defosforyleringssignalerne fungerer sandsynligvis i samspil med CAP1-fosforyleringssignalerne for at regulere CAP1-cellefunktioner ved at drive transient fosforylering ved S308/S310.

Depletion af CAP1 i pancreaskræftceller reducerede FAK-aktiviteten, men forårsagede ikke ændringer i ERK eller celleproliferation

Vi identificerede for nylig en ny rolle for CAP1 i reguleringen af brystkræftcellers proliferation, hvor depletion af CAP1 udøver cellekontekstafhængige virkninger på proliferation, ledsaget af konsistente ændringer i ERK-aktivitet18. Vi testede, om CAP1 også kan regulere ERK og proliferation i bugspytkirtelkræftceller. Der blev ikke påvist nogen signifikante ændringer i ekspression eller fosforylering af ERK i de stabile CAP1-knockdown PANC-1 kloner sammenlignet med kontrolcellerne (Supplerende fig. 3A). Vi udførte også MTT-analyser, der testede proliferation af S2-1 og S3-3 stabile knockdown-celler og sammenlignede dem med kontrolcellerne (Vec) og påviste en let nedsat celleproliferation i knockdown-cellerne (Supplerende fig. 3B). Forskellene var imidlertid statisk ubetydelige, med P-værdierne, der sammenligner O.D. (ved 570 nm) mellem S2-1-celler og kontrolceller på 0,219, og den mellem S3-3-celler og kontrolceller på 0,223. Disse resultater tyder på, at CAP1 ikke spiller en væsentlig rolle i reguleringen af proliferation i bugspytkirtelkræftceller. I betragtning af den generelle tendens til, at det stabile knockdown-paradigme er tilbøjeligt til klonvariationer, genererede vi desuden puljer af CAP1-stabile knockdown PANC-1-celler, som menes at afspejle virkningerne af CAP1-depletion på ERK mere nøjagtigt ved at undgå potentiel indflydelse fra udvælgelsesbias. Som vist i Fig. 7A blev puljer af PANC-1 stabile celler med effektiv CAP1 knockdown, der stammer fra både S2- og S3 shRNA-konstruktionerne, etableret efter Neomycin-selektion, hvilket blev bekræftet i Western Blotting. I overensstemmelse med resultaterne fra brugen af stabile knockdown-kloner blev der ikke påvist nogen bemærkelsesværdige ændringer i ERK-ekspression eller dens fosforylering i knockdown-puljecellerne sammenlignet med kontrolpuljecellerne.

Knockdown af CAP1 i brystkræftceller forårsagede forskellige ændringer i FAK i de metastatiske og ikke-metastatiske brystkræftceller18. Vi påviste også reduceret FAK-aktivitet, uden ændringer i FAK-ekspressionsniveauerne, i CAP1-knockdown PANC-1 poolkræftcellerne (Fig. 7B). På baggrund af disse resultater testede vi yderligere effekter af CAP1-depletion på celleadhæsion i adhæsionsassays, på samme måde som vi tidligere har udført12,18. Vi fandt, at CAP1-knockdown poolcellerne afledt af begge shRNA-konstruktioner havde bemærkelsesværdigt reduceret celleadhæsion sammenlignet med kontrolcellerne (Fig. 7C). På begge tidspunkter (45 minutter og 2 timer), efter at cellerne var blevet udplottet på en fibronectinbelagt overflade, hæftede betydeligt flere kontrolceller sig sammenlignet med CAP1-knockdown poolcellerne. Endvidere havde flere af de fasthæftede kontrolceller også spredt sig fuldt ud (udviklet lamellipodier, og cellerne er ikke så lyse) sammenlignet med CAP1-knockdown-cellerne (fig. 7C). Vi scorede antallet af fasthæftede celler fra tre felter til sammenligning, og data fra tre uafhængige eksperimenter blev kvantificeret som plottet i grafen (Fig. 7D).