Abstract
Danggui Buxue Tang (DBT), et urtedekokt, der indeholder Astragali Radix (AR) og Angelicae Sinensis Radix (ASR), har været anvendt til behandling af menopausale uregelmæssigheder hos kvinder i mere end 800 år i Kina. Farmakologiske resultater viste, at DBT udviste betydelige østrogene egenskaber in vitro, hvilket derfor tyder på, at DBT kan aktivere de nukleare østrogenreceptorer. Her vurderede vi DBT’s østrogeniske egenskaber i en ovariektomeret in vivo rottemodel: DBT blev påført de ovariectomerede rotter i 3 dage. Anvendelsen af DBT ændrede ikke vægten af uterus og lever samt transkriptudtrykket af proliferationsmarkører, herunder østrogenreceptorerne α og β. DBT stimulerede imidlertid transkriptudtrykket af de østrogenresponsive gener. Desuden blev DBT’s induktive rolle på ekspressionen af medlemmer af arylhydrogencarbonreceptorfamilien i uterus og lever hos ovariectomerede rotter bekræftet. Disse reaktioner af DBT var imidlertid klart adskilt fra det reaktionsmønster, der her kunne påvises for 17β-estradiol. DBT udviste derfor svage, men betydelige østrogene egenskaber in vivo; nogle af dets aktiviteter var dog uafhængige af østrogenreceptoren. DBT kunne således være et spændende kinesisk urteafkog til en alternativ behandling af hormonsubstitutionsbehandling for kvinder i overgangsalderen uden efterfølgende østrogeniske bivirkninger.
1. Introduktion
Traditionel kinesisk medicin (TCM) er blevet brugt som medicin eller kosttilskud i Kina i over tusind år. Historisk set fremstilles TCM’er som afkogninger efter en unik metode med specifikke kombinationer af forskellige urter som en formel. Blandt tusindvis af urteformler er Danggui Buxue Tang (DBT) et simpelt urtedekokt, der består af to urter. DBT blev første gang beskrevet i Neiwaishang Bianhuo Lun af Li Dongyuan i Kina i 1247 e.Kr. i Neiwaishang Bianhuo Lun af Li Dongyuan. Li beskrev, at DBT-formlen skulle indeholde 10 qian Astragali Radix (AR), rødder af Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge eller Astragalus membranaceus (Fisch.) Bungevar. mongholicus (Bunge) P.K. Hsiao, og to qian Angelicae Sinensis Radix (ASR), rødder af Angelica sinensis (Oliv.) Diels. En qian svarer til ca. 3 g. DBT er ordineret til kvinder i Kina som et middel mod symptomer i overgangsalderen, som forbedrer deres helbred ved at hæve “Qi” (livsenergi) og nære “blodet” (kroppens cirkulation).
Kvinder i overgangsalderen lider af hedeture, svedeture, angst og humørsvingninger samt af en øget risiko for mange sundhedsproblemer, såsom tab af knogletæthedsmasse (osteoporose) og hjerte-kar-sygdomme. Disse problemer skyldes i høj grad manglen på hormoner fra æggestokkene, især østrogener . Hormonerstatningsterapi (HRT) har i mange år været anvendt til at lindre menopausale symptomer, men denne behandling var forbundet med bivirkninger, dvs. en øget risiko for brystkræft, hjerteanfald og slagtilfælde . I lyset af disse kliniske risici er der blevet gjort en stor indsats for at finde eller udvikle nye lægemidler, som ville give samme fordele som hormonbehandling, men med minimal risiko . TCM, som indeholder tusindvis af medicinske urter, er en lovende ressource, som kunne give en perfekt løsning . Nogle af urteprodukterne viste faktisk en udpræget effektivitet i forbindelse med menopausale symptomer og blev derfor i vid udstrækning anvendt af kvinder til at lindre deres menopausale symptomer, f.eks. In vitro-forsøg med celler fra brystkirtler og knogler tyder på, at i det mindste en del af DBT’s effektivitet formidles gennem østrogenreceptor- (ER-) afhængige mekanismer. For at understøtte disse observationer in vivo blev DBT testet i den ovariectomerede Wistar-rotte-model med henblik på potentielle østrogene egenskaber. Da DBT er et afkog, der traditionelt indtages som te, blev dyrene suppleret med DBT gennem drikkevandet. Med denne tilgang udførte vi et tre-dages uterotrofisk forsøg for at afsløre reaktioner, der er relevante for at bidrage til at klarlægge de molekylære virkningsmekanismer af DBT, herunder organvægte og regulering af genekspression.
2. Materialer og metoder
2.1. Plantematerialer og DBT-fremstilling
Treårig AR afledt af rødderne af A. membranaceus var. mongholicus blev indsamlet fra Shanxi-provinsen , og 2-årig ASR af A. sinensis var fra Minxian i Gansu-provinsen . Disse plantematerialer var blevet morfologisk autentificeret af Dr. Tina Dong under indsamlingen i marken. De tilsvarende bilag i form af hele planter, bilag nr. 02-9-1 for ASR og bilag nr. 02-10-4 for AR, blev deponeret i Center for Chinese Medicine, The Hong Kong University of Science and Technology. 17β-Estradiol (E2) blev fremstillet af Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Tyskland). 250 g skiveskåret AR og 50 g skiveskåret ASR blev blandet (forholdet er 5 : 1) og derefter kogt i 2 400 mL (w : v = 1 : 8) vand i 2 timer, hvorefter afkoget blev filtreret. Resterne blev kogt i 1 800 mL (w : v = 1 : 6) vand i 1 time. De kombinerede ekstrakter blev tørret under vakuum og opbevaret ved -20 °C. Denne ekstraktion, der følger den antikke fremstilling, viste sig at være den bedste ekstraktionsbetingelse . To kemiske markører i AR (calycosin og formonononetin) og to andre i ASR (ferulinsyre og ligustilid) blev anvendt til at standardisere den kemiske egenskab af DBT. Den standardiserede DBT bør ikke indeholde mindre end 0,186 mg calycosin, 0,155 mg formonononetin, 0,351 mg ferulinsyre og 0,204 mg ligustilid pr. 1 g tørvægt af DBT, som tidligere rapporteret .
2.2. Dyr
Unge Wistar-rottehunner ( g) blev anskaffet fra Harlan Winkelmann (Borchen, Tyskland) og blev holdt under kontrollerede forhold med hensyn til temperatur (20°C ± 1, relativ luftfugtighed 50-80%) og belysning (12 timer lys, 12 timer mørke). Alle rotter havde fri adgang til standard rottefoder (SSniff R10-Diet, SSniff GmbH, SSniff GmbH, Soest, Tyskland) og vand. Alle dyreholdelses- og håndteringsforhold var i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee i Tyskland.
2.3. Uterotrofisk forsøg
Østrogeniciteten blev testet i 3-dagesforsøg på ovariectomerede rotter i henhold til OECD-retningslinje 440 . De eksperimentelle procedurer er skematisk opsummeret i figur 1. Kort fortalt blev dyrene efter ovariektomi og 14 dages endogent hormonelt fald behandlet i 3 dage. Dyrene blev tilfældigt fordelt til behandling med urteekstrakter, positiv kontrol eller vehikelgrupper (). DBT blev administreret oralt i doserne 0,01 g/kg BW/d eller 1 g/kg BW/d BW og E2 (1 μg/kg BW/d; subkutan injektion), som fungerede som positiv kontrol. Dyrene blev ofret ved dekapitation efter let bedøvelse med CO2-inhalation. Vådvægten af uterus og lever blev bestemt. Uterus og lever blev frosset ned i flydende nitrogen til RNA-præparering.
Eksperimentelt design. Figuren opsummerer undersøgelsens forsøgsdesign. Den viser skematisk arbejdsgangen samt en oversigt over de inkluderede behandlingsgrupper. bw: kropsvægt; DBT: Danggui Buxue Tang; DBT01 og DBT1: DBT01 og DBT01: DBT ved 0,01 og 1 g/kg lgv/d.
2.4. Fremstilling af total RNA og omvendt transskription
Det totale cytoplasmatiske RNA blev ekstraheret fra rotteuterne ved hjælp af standard TRIzol-metoden (Invitrogen, Grand Island, NY). DNA-rester blev enzymatisk elimineret ved fordøjelse (Deoxyribonuklease I, Ambion, Foster City, CA), og fjernelsen blev kontrolleret ved PCR. Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) og Oligo (dT) 12-18 blev anvendt til første-strengs cDNA-syntese.
2.5. Kvantitativ realtids-PCR
Kvantitativ realtids-PCR blev udført med Platinum Taq DNA-polymerase (Invitrogen) ved hjælp af iCycler termisk cycler med iQ realtidsdetektionssystem. Reaktionerne blev kørt tre gange i tre eksemplarer. Efter vortexing blev 50 μL alikvater af blandingen pipetteret i hver brønd i 96-hullers PCR-plade med tynde vægge (Bio-Rad, Hercules, CA). PCR-reaktionerne bestod af en første denatureringscyklus ved 95 °C i 3 minutter, efterfulgt af 50 cyklusser på 10 s ved 95 °C, 15 s ved 60 °C og 30 s ved 72 °C. Fluorescensen blev kvantificeret ved afslutningen af annealingstrinnet ved 60 °C, og produktets identitet blev bekræftet ved en smeltekurveanalyse (60-95 °C). Primersekvenser og ampliconstørrelser er opsummeret i den supplerende tabel 1 i det supplerende materiale, der er tilgængeligt online på http://dx.doi.org/10.1155/2014/438531. De relative mRNA-mængder af målgenerne blev beregnet efter normalisering i forhold til et endogent referencegen (cytokrom C oxidase subunit 1, COX1). Resultaterne blev udtrykt som relative mRNA-mængder sammenlignet med dyrene i kontrol med vehikel ved hjælp af formlen .
2,6. Statistisk analyse
Statistisk analyse af dataene i dette arbejde blev udført ved hjælp af tovejs variansanalyse efterfulgt af parvis sammenligning af udvalgte gennemsnit ved hjælp af Student’s -test. Kriteriet for signifikans blev sat til , , og i forhold til kontrollen.
3. Resultater
3.1. Kropsvægt og organers vådvægt
Den uterotrofiske respons hos ovariectomerede rotter blev målt efter 3 dages lægemiddelbehandling. DBT blev anvendt i to doser på 0,01 (DBT0,01) og 1 (DBT1) g/kg BW/d. E2 blev anvendt som positiv kontrol med 1 μg/kg BW/d, og bærestoffet ricinusolie blev anvendt som negativ kontrol. Disse behandlinger kunne ikke påvirke dyrenes kropsvægt (figur 2(a)). Med hensyn til vådvægtene forårsagede E2-behandling i 3 dage en signifikant stigning i uterus-vådvægten på mere end 5 gange, men påvirkede ikke levervægten (figur 2(b)). Behandlingen med DBT, for begge koncentrationer af DBT0,01 og DBT1, havde ingen virkning på vægten af uterus og lever (figur 2(b)). Denne observation var i overensstemmelse med ekspressionen af mRNA af Ki-67, en følsom proliferationsmarkør i livmoderen, som dog var uændret efter DBT-behandlingen (figur 2(c)). Ekspressionen af Ki-67 mRNA er stærkt stimuleret som reaktion på behandlingen med E2 (figur 2(c)). I leveren resulterede ingen af behandlingerne i en statistisk signifikant indvirkning på ekspressionen af Ki-67 (figur 2(c)).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Effekten af E2 eller DBT på dyrenes krops- og organvægt. (a) De ovariectomerede dyr blev behandlet med E2 (ved 1 μg/kg BW/d; subkutant) eller DBT (ved 0,01 g/kg/d BW og 1 g/kg/d BW, oralt) i tre dage; ubehandlede ovariectomerede dyr tjente som kontrolgruppe (Ctrl.). Kropsvægten af rotterne før ofring blev bestemt. De våde organer, herunder uteri og lever, blev vejet. (c) Reguleringen af mRNA-ekspressionen af proliferationsmarkørerne Ki-67 i uterus og lever blev analyseret ved semikvantitativ realtids-PCR-analyse. Asteriskerne angiver værdier, der er signifikant forskellige fra de respektive kontroller. , , , og .
3.2. Østrogen-associeret genekspression i uterus og lever
Den mRNA-ekspression af ERα og ERβ var blevet påvist i rotte-uterus under alle behandlingsbetingelser. Efter behandlingen med E2 viste ERα- og ERβ-mRNA’erne den forventede signifikante nedregulering sammenlignet med kontroldyrene, mens DBT-anvendelse ikke kunne påvirke mRNA-ekspressionen af ERα og ERβ (Figur 3(a)). Med hensyn til ER-indsatsen i livmoderen er nogle meget følsomme markørgener kendt for at overvåge de østrogene reaktioner, dvs. komplement C3 (C3), calciumbindende protein 9 kDa (CaBP9k) og clusterin (Clu). I livmoderen resulterede E2-behandling i en flere hundrede gange signifikant opregulering af mRNA, der koder for C3 og CaBP9k, ledsaget af en signifikant nedregulering af Clu mRNA-ekspression (figur 3(b)). Tilsyneladende var DBT i stand til at udløse en meget mild opregulering (ikke over 5 gange) af de ER-afhængigt regulerede gener C3 og CaBP9k. Den højere dosis DBT forårsagede en nedregulering af Clu mRNA-ekspressionen, som ikke nåede op på niveauer af statistisk signifikans på grund af den høje standardafvigelse af middelværdien (figur 3(b)).
(a)
(b)
(a)(b)
(b)
(b)
Regulering af ekspression af østrogenreceptorer og østrogenresponsgener i uterierne. (a) mRNA-ekspressionen af ERα og ERβ i uteri og (b) mRNA-ekspressionen af østrogenresponsgener, herunder C3, CaBP9k og Clu, blev analyseret ved kvantitativ realtids-PCR-analyse. Asteriskerne angiver værdier, der er signifikant forskellige fra de respektive kontroller. , , og .
Den mRNA-ekspression af ERα var blevet påvist i rotteleveren under alle behandlingsbetingelser. Det autoregulatoriske respons på nedregulering af ERα ved E2 nåede ikke op på niveauet for statistisk signifikans, mens begge DBT-koncentrationer nedregulerede mRNA-niveauerne af ERα i steady state på en statistisk signifikant måde (figur 4(a)). For at vurdere ekspressionen af ERα-afhængige responsgener i leveren blev ekspressionsniveauerne af egnede leverspecifikke ER-responsgener, dvs. CaBP9k og insulinlignende vækstfaktorbindende protein I (IGFBP1), bestemt. E2-behandlingen resulterede i en opregulering af CaBP9k mRNA-ekspression og i en nedregulering af 1GFBP1 mRNA-ekspression i leveren (figur 4(b)). Behandlingen med høj dosis DBT (DBT1) reducerede ekspressionen af IGFBP1 betydeligt. Den øgede ekspression af CaB9k blev afsløret efter DBT-behandling ved begge koncentrationer, men nåede i begge tilfælde ikke op på niveauet for statistisk signifikans på grund af variationen (figur 4(b)).
(a)
(b)
(a)
(b)
(a)
(b)
Regulering af ekspression af østrogenreceptorer og østrogenresponsgener i lever. Den mRNA-ekspression af ERα i lever (a) og mRNA-ekspressionen af østrogenresponsgenerne, herunder CaBP9k og IGFBP1 i lever (b), blev analyseret ved kvantitativ realtids-PCR-analyse. Asteriskerne angiver værdier, der er signifikant forskellige fra de respektive kontroller. , , , og .
3.3. Lipidmetabolisme-associeret genekspression i leveren
Da DBT menes at øge “Qi”, undersøgte vi ekspressionen af gener, der er forbundet med lipidmetabolisme. Da leveren er det vigtigste sted for lipidmetabolisme, er leverfunktionen forbundet med fedme, som igen er en risikofaktor for sygdomme i hormonafhængige organer, som f.eks. brystkræft. Vi undersøgte derfor ekspressionen af apolipoprotein A-I (Apo-A1), som er den vigtigste komponent i HDL-kolesterol, og af peroxisome proliferator-aktiverede receptorer (PPAR), som repræsenterer lipidsensorer og på forskellige måder er involveret i reguleringen af energistofskiftet. Opreguleringen af PPARα ved DBT nåede ikke op på et statistisk signifikant niveau. Med hensyn til PPARγ nedregulerede DBT i en koncentration på 1 g/kg BW/d ekspressionen af dets mRNA (figur 5(a)). Denne nedregulering svarede til den, der blev induceret af E2. Derimod var der en virkning, som klart var uafhængig af DBT’s potentielle østrogene egenskaber, nemlig den udprægede nedregulering af PPARδ mRNA-ekspressionen ved begge DBT-doser (figur 5(a)). Disse resultater peger klart på, at DBT kan regulere ekspressionen af receptorer, der er tæt involveret i reguleringen af tilgængeligheden og forbruget af energi fra fedt gennem modulering af ekspressionen af receptorerne i PPAR-familien. Som en potentiel forbindelse til komplikationer i forbindelse med det metaboliske syndrom er reguleringen af kolesterolmetabolismen af interesse. Vi har derfor vurderet reguleringen af ekspressionen af Apo-A1 mRNA. Ekspressionsmønstret tyder på en østrogenlignende egenskab af DBT i en koncentration på 1 g/kg BW/d, der ligesom E2 nedregulerede ekspressionen af Apo-A1 mRNA.
(a)
(b)
(a)
(b)
Genekspressionen af peroxisome proliferator-aktiverede receptorer og Apo-A1 i lever. (a) Den mRNA-ekspression af PPARα, PPARγ og PPARδ i lever blev analyseret ved kvantitativ realtids-PCR-analyse. (b) mRNA-ekspressionen af Apo-A1 i lever blev analyseret ved kvantitativ realtids-PCR-analyse. Asteriskerne angiver værdier, der er signifikant forskellige fra de respektive kontroller. , , og .
3,4. Regulering af DBT på Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway i Uterus og Lever
Effektiv afgiftning er også afgørende for sundheden. Arylhydrogencarbonreceptoren (AHR) er kendt for at udløse ekspressionen af metaboliserende/afgiftende enzymer i leveren og andre væv, som virker på en koordineret måde med batteriet af Nrf2-regulerede enzymer. Her undersøgte vi ekspressionen af AhR, AhR-familiemedlemmer og AhR-responsive gener i livmoderen og leveren ved DBT i sammenligning med E2. Samlet set påviste vi en vævsspecifik regulering af ekspressionen af AhR, AhR-familiemedlemmer og responsgener efter behandling med DBT.
I livmoderen blev AhR mRNA-ekspressionen kraftigt nedreguleret som reaktion på E2, mens der ikke var nogen ændring synlig som reaktion på DBT (Figur 6(a)). Ekspressionen af arylhydrogencarbonreceptor nuclear translocator 1 (ARNT 1) mRNA, koregulator af AHR, blev nedreguleret af E2, mens DBT i høj dosis fører til en opregulering af ARNT1 mRNA-niveauer i dette organ. Med hensyn til ARNT2 resulterede en stærk nedregulering af mRNA-ekspressionen i livmoderen som reaktion på E2-behandling, en effekt, der ikke kunne påvises som reaktion på DBT (figur 6(b)). Cytokrom P450 (familie 1) A1 (Cyp1A1) og Glutathion-S-transferaser Ya (GST-Ya) anses for at være meget følsomme responsgener for AhR-funktion. Cyp1A1 mRNA-niveauer i livmoderen blev kraftigt nedreguleret af E2, en effekt, der også kunne påvises som reaktion på begge DBT-doser, men i mindre grad (Figur 6(c)). GST-Ya mRNA-ekspression blev kun fundet at være opreguleret som reaktion på E2. DBT-behandling i begge doser påvirkede ikke GST-Ya mRNA-ekspressionen i livmoderen (figur 6(c)).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Regulering af ekspression af AhR-relaterede gener i livmoderen. (a) mRNA-ekspressionen af AhR i uteri, (b) mRNA-ekspressionen af ARNT1 og ARNT2 i uteri og (c) mRNA-ekspressionen af Cyp1A1 og GST-Ya i uteri blev analyseret ved semikvantitativ realtids-PCR-analyse. Asteriskerne angiver værdier, der er signifikant forskellige fra de respektive kontroller. , , og .
I leveren kunne der påvises en mild, statistisk ikke signifikant opregulering af AhR mRNA som reaktion på E2-behandling, mens DBT kraftigt inducerede AhR mRNA-ekspression til over 3 gange (Figur 7(a)). ARNT1’s mRNA-niveau kunne kun induceres af den lave dosis DBT, men ikke for E2 og høj dosis DBT. Desuden syntes alle tre behandlinger at opregulere ARNT2 mRNA-ekspressionen; ingen af værdierne kunne dog nå op på niveauet for statistisk signifikans (figur 7(b)). E2-behandling resulterede i en mild, men ikke signifikant opregulering af Cyp1A1 mRNA-niveauerne, mens DBT nedregulerer Cyp1A1 mRNA-ekspressionen på en dosisafhængig måde. Tværtimod resulterede E2-behandling ikke i en ændring af mRNA-ekspressionen af GST-Ya, mens DBT i høj dosis nedregulerede GST-Ya mRNA-ekspressionen på en statistisk signifikant, dosisafhængig måde (figur 7(c)).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Regulering af ekspression af AhR-relaterede gener i lever. (a) mRNA-ekspressionen af AhR i lever, (b) mRNA-ekspressionen af ARNT1 og ARNT2 i lever, og (c) mRNA-ekspressionen af Cyp1A1 og GST-Ya i lever blev analyseret ved semikvantitativ realtids-PCR-analyse. Asteriskerne angiver værdier, der er signifikant forskellige fra de respektive kontroller. , , og .
4. Diskussion
Selv om DBT udviste potentielle østrogene virkninger in vitro , er oplysningerne om potentielle hormonelle aktiviteter af DBT in vivo begrænsede. Det er velkendt, at proliferation af endometrieceller er under kontrol af østrogener, og at risikoen for endometriekarcinom øges med østrogenerstatningsterapi . Da naturlige forbindelser med østrogenlignende aktiviteter ofte udviser organselektive egenskaber in vivo, evaluerede vi desuden det uterotrofe eksperiment, der blev udført på en organafhængig måde. Vi vurderede potentielle virkninger af DBT i livmoderen, som er et organ i reproduktionskanalen, der repræsenterer et klassisk målorgan for østrogenvirkning, og i leveren som det vigtigste metaboliske sted, der er et af de organer, der udtrykker ERα overvejende. For at undersøge indflydelsen af DBT i fravær af endogent østrogen anvendte vi derfor ovariectomerede hunrotter for at evaluere DBT’s ER-selektivitet i uterus og lever.
Resultaterne viste, at DBT ikke ændrede uterus og leverens vådvægt eller niveauet af ekspression af proliferationsmarkører og ER’er ved nogen af de undersøgte doser. For ER-indsats i livmoderen er der kendskab til nogle meget følsomme markørgener, som opfanger østrogene reaktioner, dvs. opregulering af C3 og CaBP9k og nedregulering af Clu. C3 og CaBP9k kunne opreguleres af E2, mens Clu blev nedreguleret som reaktion på E2-behandling i livmoderen. DBT efterlignede meget mildt østrogene reaktioner for C3 og CaBP9k, men ikke for Clu. Dette er interessant, da opregulering af C3 og CaBP9k involverer ERE-responselementer, mens den præcise mekanisme for ER-medieret nedregulering af Clu ikke er kendt. Det er imidlertid sandsynligt, at de transkriptionsfaktorbindingssteder, der er indeholdt i Clu-promotoren, afspejler inddragelsen af SP1- og AP-medierede processer . Parallelt hermed var leverændringer i ekspressionen af CaBP9k og IGFBP1 blevet etableret som østrogene responsmarkører, selv om det samlede respons var langt lavere end det, der kunne påvises for CaBP9k eller C3 i livmoderen. I leveren udøvede DBT igen svage østrogene egenskaber i 3-dages uterotrofisk assay. Effekter kunne kun påvises ved hjælp af de mest følsomme genekspressionsmarkører for østrogenvirkning.
Lever er desuden et vigtigt sted for lipidmetabolisme, som er forbundet med fedme, og som igen er en risikofaktor for sygdomme i hormonafhængige organer som f.eks. brystkræft. Vi undersøgte derfor ekspressionen af Apo-A1 som den vigtigste komponent i HDL-kolesterol og af PPAR-receptorer, som på forskellige måder er involveret i reguleringen af energistofskiftet. De er også kendte mål for naturforbindelser, og binding til dem forbedrer f.eks. glukoseoptagelsen . Vores resultater peger klart på, at DBT gennem modulering af ekspressionen af receptorerne i PPAR-familien kan bidrage til regulering af tilgængeligheden og udnyttelsen af energi fra fedt. Talrige oversigter opsummerer reguleringen af metaboliske veje efter aktivering af PPAR’er , et emne, som ikke er i fokus i denne artikel. To træk ved vores resultater vedrørende PPAR fortjener dog en diskussion. Der blev observeret en stærk nedregulering af PPARδ som reaktion på DBT. I denne forbindelse er det vigtigt at nævne, at PPARδ tilsyneladende reagerede på DBT-behandling på en østrogen/ER-uafhængig måde. De funktionelle konsekvenser af nedreguleringen af PPARδ-ekspressionen ved DBT må forblive åbne på dette punkt; det skyldes dog ikke en autoregulatorisk nedregulering af PPARδ efter binding af bestanddele af DBT, fordi DBT hverken stimulerede PPARδ eller PPARγ-afhængig reportergenaktivering i et transient transfektionsassay (data ikke vist). Aktivering af en PPARδ-afhængig signalkaskade ved DBT ville imidlertid være interessant, da PPARδ er den vigtigste regulator for mobilisering af fedt og energiforbrug fra fedt og på grund af denne fænotype potentielt forbundet med fedme og forebyggelse heraf.
Det modsatte reagerede PPARγ i det mindste ved en høj dosis DBT på en østrogenlignende måde ved at blive nedreguleret. Et vigtigt træk ud over PPARγ’s insulinsensibiliserende egenskaber er, at det bestemmer stamcelleskæbnen af mesenkymale stamceller. Skeletvirkninger af PPARγ er i mellemtiden veletableret. Det aktiverer adipogen differentiering og hæmmer derved osteogen differentiering . Denne situation ville være ufordelagtig for kvinder i overgangsalderen, og derfor kan nedregulering af PPARγ med DBT pege på en gavnlig effekt.
Det er længe kendt, at AhR-vejen udløser ekspressionen af metaboliserende enzymer i leveren og i andre væv for det meste på en koordineret måde med batteriet af Nrf2-regulerede enzymer , hvorved den bidrager til afgiftningsprocessen. Vi har for nylig vist, at der er en sammenhæng mellem østrogenfunktion og regulering af AhR og medlemmer AhR-signalkaskade i livmoderen . Derfor undersøgte vi sammenlignende reguleringen af ekspressionen af AhR, AhR-familiemedlemmer og AhR-responsgener i livmoderen og leveren ved DBT i sammenligning med østradiol. Først bekræftede vi det østrogene responsmønster for AhR-genbatteri medlemmer . For DBT-behandling påviste vi generelt en vævsspecifik regulering af ekspressionen af AhR, AhR-familiemedlemmer og responsgener efter behandling med DBT. Cyp1A1 og GST-Ya, der ud over at være medlemmer af første (Cyp1A1) og anden overgang (GST-Ya) metaboliske enzymer, betragtes som meget følsomme responsgener med hensyn til crosstalk-mekanismer, der involverer AhR- og ER-veje, og her blev de også testet. Som en interessant observation viste DBT-behandling et østrogenlignende responsmønster for regulering af Cyp1A1-ekspression, men ikke for GST-Ya, hvilket tyder på, at DBT-funktionen i leveren er forbundet med både østrogenlignende og østrogenuafhængige egenskaber. Det samme gælder formodentlig for AhR-udløste responser. For fremtiden vil det være interessant at se, om DBT og/eller dets bestanddele vil udløse AhR-medierede reportergenaktiviteter.
Dertil kommer, om end svagt, at vi fandt ARNT-molekyler, der blev opreguleret af DBT i leveren. Dette er interessant, da nogle af de forfattere, der er involveret i denne artikel, for nylig beskrev opregulering af HIF1α af DBT, hvilket i sidste ende fører til opregulering af erythropoietin . ARNT1 kaldes også HIF1β og repræsenterer den heterodimere dimeriseringspartner for HIF1α i formidlingen af dets nukleare reaktioner . Med andre ord viser vi her, at DBT opregulerer ikke kun HIF1α, men også HIF1β/ARNT1 og dermed potentielt understøtter effekten af HIF1α på erythropoiesis.
Sammenfattende viste vi for første gang, at DBT regulerer mRNA-niveauerne af medlemmer af AhR-signalkaskaden og derved udviser både østrogenlignende og østrogenreceptoruafhængige aktiviteter, hvilket formodentlig fører til et særskilt mønster af afgiftningsmekanismer. Det sidste vigtige resultat var, at virkningerne af DBT synes at være organselektive, idet de påvirker funktioner, der er relevante for menopausens sundhed. På sikkerhedssiden var der ingen indikation for østrogenafhængig stimulering af proliferation i reproduktionsorganer. Med hensyn til effektivitet udviser DBT svage østrogene egenskaber og regulerer ekspressionen af funktionelt forbundne lipidsensorer, der bl.a. omfatter PPAR- og AhR-molekylfamilierne , idet sidstnævnte har forbindelse til afgiftning og energistofskifte. Vi antager, at DBT derfor kan have egenskaber, som direkte og indirekte har indflydelse på menopausernes sundhed.
Abkortninger
| TCM: | Traditionel kinesisk medicin |
| DBT: | Danggui Buxue Tang |
| ASR: | Angelicae Sinensis Radix |
| AR: | Astragali Radix |
| AhR: | Arylhydrogencarbonreceptor |
| Apo-A1: | Apolipoprotein A-1 |
| E2: | 17β-Estradiol |
| ER: | Estrogenreceptor |
| ERE: | Estrogen response element |
| HRT: | Hormonerstatningsterapi |
| PPAR: | Peroxisome proliferator-aktiveret receptor. |
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.
Anerkendelser
Denne forskning blev støttet af tilskud fra Research Grants Council of Hong Kong (HKUST 6419/06 M og N_HKUST629/07, 662608), Croucher Foundation (CAS-CF07/08.SC03) til Karl W. K. Tsim, og German Research Foundation (DFG Vo410/6-5) og German Academic Exchange Service (DAAD 50023165) til Günter Vollmer. Bidragydere fra TU-Dresden anerkender støtte fra den tyske forskningsstiftelse og Open Access Publication Funds of te TU-Dresden.
Supplementary Materials
Genekspressionsanalyse blev udført i RNA-præparater fra vævsprøver fra livmoder og lever. Oplysninger om analyserede gener, anvendte primersekvenser samt ampliconstørrelser er angivet i Supplerende tabel 1.
- Supplementært materiale