Søger du at begynde at bruge blodprøver i din translationelle forskning? Måske er du interesseret i metastatisk brystkræft eller ikke-småcellet lungekræft. Eller måske har udfordringerne og begrænsningerne ved solide tumorprøver fået dig til at tænke… det er på tide.
Hvad nu?
Lad os se nærmere på DNA-udbyttet og virkeligheden ved at arbejde med cellefrit DNA fra plasma. Cellefrit DNA (eller cfDNA) henviser til alt ikke-indkapslet DNA i blodstrømmen. En del af dette cellefri DNA stammer fra en tumorklon og kaldes cirkulerende tumor-DNA (eller ctDNA). cfDNA er nukleinsyrefragmenter, der kommer ind i blodbanen under apoptose eller nekrose. Normalt bliver disse fragmenter renset op af makrofager, men vi mener, at overproduktionen af celler i kræft efterlader mere af cfDNA’et tilbage. Disse fragmenter er i gennemsnit ca. 170 baser lange, har en halveringstid på ca. to timer og er til stede i både tidlige og sene sygdomsstadier i mange almindelige tumorer, herunder ikke-småcellede lunger og bryst. Når det er sagt, varierer cfDNA-koncentrationen meget og forekommer mellem 1 og 100.000 fragmenter pr. milliliter plasma.
Hvis du har været inden for næste generations sekventering i et stykke tid, vil du måske gerne vide noget om følsomhed og specificitet. Vi demonstrerede høj følsomhed og specificitet for varianter med en frekvens på mere end punkt en procent med 20 nanogram input-DNA, og mere end punkt fem procent med 5 nanogram . Hvis du vil se mere om, hvordan man gør det, kan du se vores video om cfDNA-analyser. Du har måske hørt om brug af cfDNA til analyser ved punkt nul en procent påvisningsgrænse. Selv om teknologien findes til at nå 0,01 % (digital dråbe for eksempel), er der en biologisk grænse, som vi skal tale om.
Fra en 10 mL blodprøve ved hjælp af Applied Biosystems MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit får vi rutinemæssigt omkring 20 nanogram cfDNA eller omkring 6 brugbare molekyler til analyse. En hurtig beregning viser os, at vi ved 1 % detektionsgrænse kan forvente omkring 25 molekyler. Ved 0,1 % forventes kun 2-3 molekyler at være til stede. Det betyder, at der under 0,1 % måske ikke er nogen molekyler til stede til analyse. Husk også, at cfDNA-koncentrationer er meget variable. De kan være meget lave på kritiske stadier som f.eks. tidligt tilbagefald eller udvikling af resistens, hvor mange forskere nu fokuserer. For at isolere 20 nanogram DNA fra blodplasma med succes er der både manuelle og automatiserede metoder til rådighed, afhængigt af dine behov for gennemløb.
DNA i hånden, din forskning dikterer, hvilken vej du skal gå på dette tidspunkt. Du kan vælge digital PCR til undersøgelser af recidivovervågning. Til forskning i valg af terapi kan en næste-generations sekventeringsanalyse være at foretrække. Uanset hvor din forskning i flydende biopsi fører dig hen, kan vi hjælpe dig med at nå dertil med komplette løsninger til cfDNA-analyse fra blot nogle få mål til analyser af flere gener.
Jeg håber, at vi har givet dig nogle ting at tænke over, når du overvejer at bruge cellefrit DNA i dit laboratorium. Men jeg er sikker på, at du vil have nogle spørgsmål. Så indsend dine spørgsmål på thermofisher.com/ask, og abonnér på vores kanal for at se flere videoer som denne. Og husk, når du er i tvivl, så bare Seq It Out!