Efter at være blevet læge fra Sorbonne i 1853 med en doktordisputats om forskellige former for leddegigt arbejdede Charcot først som indehaver af en privat praksis og fra 1848 som hospitalslæge på Salpêtrière, hvor han blev overlæge i 1862. I 1872 blev han professor i patologisk anatomi ved universitetet i Paris, hvor han udgav adskillige værker om nervesystemets anatomi og patologi. I 1882 blev verdens første lærestol for sygdomme i nervesystemet oprettet for Charcot på Hôpital de la Salpêtrière i Paris.
I 1883 blev Charcot optaget i Académie des sciences. Fra 1888 til 1889 udgav han sine berømte Leçons du mardi, hvor han demonstrerede kliniske tilfælde for et internationalt auditorium af læger, journalister og forfattere.
Ingen anden videnskabsmand i det 19. århundrede havde så stor en varig indflydelse på udviklingen af neurologien som Charcot. I den anden halvdel af det 19. århundrede gjorde han vigtige opdagelser inden for næsten alle områder af neurologien. Han var den første til at beskrive amyotrofisk lateralsklerose og neurogen arthropati. Han skelner også mellem multipel sklerose og Parkinsons sygdom som uafhængige sygdomsbilleder.
Den 7. juni 1884 fandt et møde sted med Henry Steel Olcott fra Det Teosofiske Selskab i Paris på Salpêtrière ved mægling af Charcots assistent Raymond Combret, der var medlem af Det Teosofiske Selskab i Paris. I sine senere år foretog Charcot hovedsageligt psykopatologiske undersøgelser af hysteri. Selv om nogle af hans resultater senere blev revideret, havde de stor indflydelse på udviklingen af psykiatrien og på psykoanalysen af hans elev Sigmund Freud. Det var Charcots kliniske brug af hypnose i et forsøg på at finde en organisk årsag til hysteri, der udløste Freuds interesse for de psykologiske årsager til neuroser.
Freud studerede hos Charcot på Salpêtrière fra august 1885. Selv om han senere med succes etablerede sin skabelse, psykoanalysen, som en selvstændig videnskab, glemmes det ofte, at den begyndte med Charcots studier af hypnose. Charcots forskning i ændrede bevidsthedstilstande forårsaget af hypnotisk trance gav anledning til andre discipliner, som var mindre i tråd med den materialistiske tidsånd end Freuds. Freud oversatte to af Charcots bøger og forsynede dem med kritiske kommentarer.
Charcot var repræsentant for den dominerende videnskab i det 19. århundrede, som havde fundet sig til rette med hypnose, og han var optaget af at finde en neurofysiologisk forklaring på de symptomer, han observerede. Han søgte en rent materialistisk forklaring, hvormed personer, der let kunne hypnotiseres, kunne betragtes som psykisk syge, og hvormed de forskellige stadier af hypnose kunne klassificeres strengt. Det var først i 1884, at hans hypoteser blev udfordret af Hippolyte Bernheim og Ambroise-Auguste Liébeault, som teoretiserede, at den hypnotiske tilstand blev frembragt ved suggestion, hvilket i sidste ende blev bevist i Liébeaults lægepraksis. Det viser sig, at Charcots tro på, at hypnose havde patologiske årsager, skyldtes det faktum, at han tilfældigvis overvejende arbejdede med hysterikere på Salpêtrière. Charcot indrømmede sit nederlag få måneder før sin død ved i en artikel at proklamere, at hysterikere i princippet var lette at suggestionere.
Charcot døde efter 1893 af et anfald af angina pectoris.
Jean-Martin Charcot, som var en kunstnerisk begavet læge siden sin ungdom og kunstinteresseret, samlede historiske fremstillinger af hysteri. Han introducerede også fotografiet som en metode til klinisk dokumentation på den ene side og som en didaktisk metode i undervisningen (projektion af lysbilleder) på den anden.
Charcots værker er beskrevet i detaljer af Axel Munthe i The Book of San Michele. Der findes også en detaljeret beskrivelse af Charcot i Henri F. Ellenbergers standardværk The Discovery of the Unconscious: History and Development of Dynamic Psychiatry from its Beginnings to Janet, Freud, Adler and Jung.
Andre berømte elever af Charcot var Georges Gilles de la Tourette, Joseph Babinski, Gheorghe Marinescu, Pierre Janet og Charles-Joseph Bouchard.