Kloridionkanaler og -transportører: fra naturens kuriositeter og kilde til menneskelige sygdomme til lægemiddelmål

Dette opfylder stort set alle behov fra klasseværelset til forskningslaboratoriet, indtil vi ser på chloridkanaler. Vi ved, at de findes, at de er vigtige og kan være gode lægemiddelmål inden for flere sygdomsområder, men indtil for nylig har de været noget stigmatiserede og umoderne i den terapeutiske verden. Manglen på selektive ligander har slet ikke hjulpet. Den eneste undtagelse fra dette har været GABA-A-receptoren, som er koblet til en indbygget kloridkanal, der åbnes ved binding af den hæmmende neurotransmitter GABA. Benzodiazepiner har potenseret denne receptor lige siden Valium blev tilgængelig i 1960’erne, hvilket har givet beroligende og antikonvulsive virkninger. Dette introducerer et vigtigt begreb: der findes flere genfamilier og forskellige proteintyper, der kan beskrives som værende kloridkanaler.

Dette står i modsætning til, hvad vi forstår ved kation-selektive ionkanaler, hvor der er lidt fleksibilitet i proteinstrukturen, som kan danne en pore, der er selektiv for kalium, natrium eller calcium; mangfoldigheden af disse ionkanaler skyldes variationer i de proteindomæner, der adskiller sig fra poren, og som påvirker åbnings- og lukningsadfærden. Retfærdigvis skal det siges, at der ikke synes at være mange fysiologiske grunde til, at en anionkanal skulle udvise kloridselektivitet, da der kun er ringe fysiologisk rolle i membrantransporten af andre halogenider eller små anioner; enhver anionkanal vil som standard være en kloridkanal set ud fra et fysiologisk synspunkt. På den anden side spiller kalium-, natrium- og calciummembranstrømme hver især forskellige grundlæggende roller, og selektiv membranpermeabilitet for disse kationer er afgørende for den cellulære funktion og faktisk for selve livet.

GABA-A-receptorer er medlemmer af cys-loop pentameriske ligand-gated ionkanalfamilier, som omfatter flere typer excitatoriske og inhibitoriske neurotransmitter-gated kanaler. CFTR-proteinet (cystisk fibrose transmembranregulator) er en nukleotidreguleret kloridkanal. Det er medlem af den mangfoldige ABC-transporterfamilie (ATP-binding cassette) og er den eneste, der ikke synes at transportere et substrat gennem en membran, men snarere fungerer som en kloridkanal. CLC-familien af spændingsaktiverede kloridkanaler stammer fra en anden særskilt genfamilie og har en generel struktur, der er unik blandt membranproteiner. Denne familie af proteiner har givet anledning til mange overraskelser i løbet af de sidste 30 år, og medlemmer af denne familie vil blive præsenteret her, og der vil også blive redegjort for, hvordan de kan betragtes som mål for lægemidler.

Andre spændende udviklinger fra kloridkanalområdet er opstået efter den molekylære identifikation af proteiner, der ligger til grund for calciumaktiverede kloridkanaler (ClCa). Funktionelt set har vi kendt deres fysiologiske rolle i nogen tid, men den nylige molekylære identifikation af kanalproteinerne har gjort det muligt at udvikle molekylære og farmakologiske værktøjer til at undersøge og ændre deres aktivitet. Denne gennemgang fokuserer på det farmakologiske potentiale ved at målrette ClCa-kanaler og CLC-proteiner; deres funktion og subcellulære lokalisering er opsummeret i figur 1.

En introduktion til CLC-proteiner

De ni medlemmer af denne proteinfamilie er CLC-1 til 7, CLC-KA og KB. Det stiftende medlem, CLC-1, er den spændingsaktiverede kloridkanal i skeletmuskulaturen og vil blive omtalt nedenfor. Der er foretaget mange funktionelle undersøgelser af en homolog med æresbetegnelsen CLC-0, som er isoleret fra det elektriske organ Electroplax, der gør det muligt for rokken at bedøve sine vandlevende ofre. Rekonstituering af CLC-0 i lipidbilayers og elektrofysiologisk registrering af strømme, der løber gennem enkelte ionkanaler, afslørede en spændende egenskab. Når man optager strøm fra et lille stykke membran, der indeholder en enkelt ionkanal, observerer man normalt udsving mellem to strømamplituder: den ene repræsenterer den lukkede kanal og den anden repræsenterer den strøm, der løber gennem den åbne kanal. Fluktuationerne afspejler overgange mellem åbne og lukkede kinetiske tilstande. Med CLC-0 var det imidlertid tydeligt, at det enkelte ionkanalprotein bestod af to ækvivalente porer, der kunne åbnes uafhængigt af hinanden1. Denne kanal blev derfor beskrevet som værende dobbeltspærret (figur 2). Det kom derfor ikke som nogen stor overraskelse, at krystalstrukturerne af homologer fra tarmbakterier afslørede, at proteinkomplekset var en dimer, hvor hver underenhed besad en ionledende vej2 (figur 2).

Den anden overraskelse opstod, da der blev udført detaljerede funktionelle eksperimenter på CLC-ec1 fra E. coli. I stedet for at fungere som en kloridkanal, som dens længe forsvundne slægtning i hvirveldyrs skeletmuskulatur, er CLC-ec1 en 2Cl-/H+-udvekslingstransporter eller antiporter med en streng 2:1-udvekslingsstokiometri3. Dette protein er vigtigt for tarmbakteriers overlevelse ved lav pH-værdi4 og udnytter sandsynligvis en kloridgradient til at holde den cellulære pH-værdi på et tolerabelt niveau. Prokaryote CLC’er kan derfor være mål for inhibitorer til behandling af patogene E. coli- eller Salmonella-infektioner4. Opdagelsen af ionudvekslingsadfærd stimulerede naturligvis yderligere bestræbelser på at fastslå, om der fandtes en sådan klorid-for-proton-udveksling i pattedyrs CLC’er, ud fra den antagelse, at Cl-/H+-udveksling måske er den egentlige funktion for arketypiske CLC’er, og at de, der identificeres som kloridkanaler, måske blot er undtagelser fra reglen. Dette synes at være tilfældet, da der er stærke beviser for, at CLC-3 til CLC-7 fungerer som 2Cl-/H+-udvekslingstransportører, der primært befinder sig i intracellulære organeller, mens CLC-1, CLC-2, KA og KB er ægte plasmamembran-kloridledende ionkanaler5-9. Da den arketypiske CLC-egenskab er udvekslingstransport, der findes i alle former for cellulært liv, kan den sidste underklasse af proteiner, de ægte kloridkanaler, derfor betragtes som “ødelagte” kloridtransportører, som har mistet koblingen af kloridtransport til bevægelsen af en anden substration.

CLC-1

Denne grundlægger af CLC-familien er skeletmusklernes spændingskoblede kloridkanal og tjener til at regulere membranpotentialet og repolarisere membranen efter aktionspotentialer for at slappe af i musklen. I de fleste væv ville vi forvente, at kaliumkanaler spiller denne rolle, hvilket de gør i hjertemuskler og glatte muskler, og at de regulerer membranens excitabilitet i andre celletyper. Det tværgående tubulussystem er en forlængelse af plasmamembranen (sarcolemma) og trænger ind i det kontraktile væv. Det er afgørende for den hurtige spredning af elektrisk aktivitet i hele musklen og orkestrerer en hurtig og kontrolleret sammentrækning. Kaliumudstrømning fra muskelcellerne til det begrænsede rum i t-tubulien vil øge den ekstracellulære kaliumkoncentration og bryde denne iongradient sammen, hvilket vil føre til langvarig membrandepolarisering. Da kloridkanaler spiller den fremherskende repolariserende rolle, forhindres dette. Funktionstabsmutationer i CLC-1 fører til myotoni hos mennesker, geder og mus (for en nylig gennemgang se10) og er karakteriseret ved nedsat muskelrelaksation, hvilket er i overensstemmelse med tabet af en repolariserende membranstrøm.

Med ekspression begrænset til skeletmuskulaturen kan CLC-1 være et attraktivt mål for lægemidler, der kontrollerer muskelkontraktion ved at øge eller mindske CLC-1-funktionen og derved reducere eller øge henholdsvis muskeleksponering. Forbindelser, der øger CLC-1-funktionen, kunne måske behandle myotoni, især i tilfælde, hvor de kunne kompensere for delvist tab af kloridkanalaktivitet. Hæmning af CLC-1 kunne reducere tærsklen for muskelkontraktion og kan være nyttig i tilfælde af muskelsvaghed eller degenerative sygdomme som f.eks. muskeldystrofi.

CLC-2

Den indadrettede kloridkanal, CLC-2, har en noget udbredt vævsfordeling. Den kan findes i centrale neuroner, hvor den regulerer neuronal aktivitet11-13. I astrocytter reguleres dens subcellulære målretning til celleforbindelser af et samspil med GlialCAM (MLC1), hvor mutationer i denne målretning forstyrrer denne målretning og forårsager megalencefalsk leukoencefalopati14. Nylige terapeutiske interesser involverer CLC-2 ekspression i tarmslimhinden og lungebronchioler, hvor den spiller en rolle i henholdsvis tarm- og lungesekretionerne. Lubiprostone, et lægemiddel, der anvendes klinisk til at lindre forstoppelse, blev foreslået at udøve sin virkning ved at aktivere CLC-2, men denne virkning er kontroversiel. Mens dette stof i nogle undersøgelser aktiverer CLC-2-kanalerne, regulerer det i andre undersøgelser CLC-2-trafikken og øger CFTR-funktionen via prostaglandinreceptoraktivering15,16. Der er dog fortsat tilstrækkelig dokumentation for, at en øget CLC-2-funktion i luftvejene kan udgøre en alternativ kloridvej ved cystisk fibrose17.

CLC-KA/KB

Disse kloridkanaler udtrykkes især i nyreepithelier og bidrager til cellemembranernes permeabilitet for passiv kloridflux. De spiller en nøglerolle i nefronets opstigende lemmer og distale tubuli, idet de udgør en basolateral rute for kloridreabsorption efter transport fra primærurinen via den apikale membran. CLCKB-genet, som koder for CLC-KB, er et af de fem gener, der ligger til grund for Bartters syndrom. Funktionstabsmutationer i CLC-KB resulterer i defekt kloridreabsorption og fører således til en saltspildsforstyrrelse, som er forbundet med polyuri. Et af de vigtigste kendetegn ved personer, der er ramt af CLC-KB-mutationer (Bartters type III), er lavt blodtryk. En mere alvorlig form af sygdommen skyldes mutationer i BSND-genet (Bartters type IV), som koder for Barttin, et accessorisk protein, der er vigtigt for trafikken af både CLC-KA og KB til plasmamembranen18. Denne form af sygdommen omfatter også sensorisk døvhed, som menes at være forårsaget af tab af trafikering af både CLC-KA og KB til epitelmembraner i det indre øre. Det formodes, at tab af enten CLC-KA- eller KB-aktivitet, men ikke begge dele, kan tolereres af det auditive system. Dette tyder på, at inhibitorer, der er selektive for enten CLC-KA eller CLC-KB, eller delvis hæmning af begge, kan fungere som et nyt loopdiuretikum med potentiale til at sænke blodtrykket og med få bivirkninger. Dette har ført til undersøgelse af deres farmakologi og til udvikling af nye inhibitorderivater med lav mikromolær affinitet19 , som havde diuretiske virkninger, når de blev givet til rotter20. På den anden side kan lægemidler, der aktiverer CLC-KB-kanalerne, øge den resterende aktivitet af defekte kanaler hos Bartters type III-patienter.

CLC-7

Af underklassen af 2Cl-/H+-udvekslingstransportører er CLC-7 et lovende mål for lægemiddelvirkning, og dens hæmning kan være gavnlig i forbindelse med osteoporose. Endnu en gang har denne indikation sin oprindelse i observationer af sygdomme hos mennesker forårsaget af tab af funktionelle mutationer i CLC-7, som forårsager osteropetrose21. I denne sygdom er osteoklasternes knogleomdannelse mangelfuld, hvilket menes at være forårsaget af defekt syre- og enzymudskillelse. Dette fører til tæt knogle, som, hvis den reproduceres af en CLC-7-hæmmer, kunne reducere opløsningen af knogle og dermed styrke skeletet hos osteoporosepatienter22,23. I proof-of-concept-undersøgelser har farmakologisk hæmning af forsuring24 eller forstyrrelse af CLC-7-funktionen ved hjælp af antistoffer25 reduceret knogleresorptionen. Hæmning af CLC-7 er dog muligvis ikke uden komplikationer, da undersøgelser hos mennesker og mus tyder på, at manglende CLC-7-funktion også kan være forbundet med neuronale lagrings- og degenerationsforstyrrelser på grund af nedsat lysosomal funktion26.

Mutationer med manglende funktion hos mennesker – erfaringer fra CFTR

Det er værd at holde en kort pause på dette punkt for at overveje, at nogle af de terapeutiske indikationer for nye CLC-målrettede lægemidler har til formål at behandle sygdomme, der er forskellige og ligger i den modsatte ende af spektret af dem, der skyldes defekt CLC-funktion. Ud over de ovenfor beskrevne sygdomme er Dent’s I-sygdom en X-bundet nyresygdom, der skyldes tab af CLC-5-funktion (se27 for en nylig gennemgang). Alle er sjældne arvelige sygdomme, og en vigtig proteindefekt involverer enten nedsat proteinaktivitet eller trafikering til målmembranen. Faktisk forårsager mange individuelle mutationer ER-retention og manglende proteinmaturering. Der kan drages en parallel til cystisk fibrose, hvor de fleste af de berørte personer har den ER-retentionelle ΔF508-mutation. Nylige og stratificerede tilgange til behandling af cystisk fibrose har været resultatet af et tostrenget angreb for at korrigere den muterede proteinfoldning (CF-korrigerende midler) og/eller øge aktiviteten af CFTR-kloridkanalerne i plasmamembranen (CF-potentiatorer). Der er ved at opstå succes med potentiatorklassen28 , som er effektiv hos patienter med mutationer, der reducerer CFTR-aktiviteten uden tab af proteinbiosyntese eller -trafik (f.eks. G551D), men effektiviteten af foldningskorrektorer (som er påkrævet i de fleste tilfælde) er endnu ikke fastslået29. Selv om de sygdomme, der er forbundet med tab af CLC-funktion, alle er sjældne genetiske lidelser, vil vi måske en dag kunne behandle personer med myotoni, Bartters syndrom, Dents sygdom og osteopetrose samt cystisk fibrose med lægemidler, der korrigerer den egentlige årsag til deres lidelse.

Calcium-aktiverede kloridkanaler

Endeligt skal der nævnes calcium-aktiverede kloridkanaler (ClCa), som har klart definerede fysiologiske roller i en række celletyper, men hvis molekylære identifikation dog har lidt under et par falske og stakåndet starter. Historien drejer sig om fire proteintyper: medlemmer af CLCA-, Bestrophin-, Tweety- og TMEM16-genfamilierne. I alle tilfælde resulterede deres rekombinante overekspression i generering af membrankloridstrømme, der stimuleres ved at øge den intracellulære calciumkoncentration og i varierende grad ved depolarisering af membranen. Rejsen for CLCA sluttede, da det blev konstateret, at der var tale om et protein, som blev udskilt, men som sandsynligvis også opregulerede membranekspressionen af ClCa-kanaler, der er endogene for ekspressionssystemet30. Tweety- og Bestrophin-proteinerne udviser ikke alle de egenskaber ved ClCa-kanaler, der er undersøgt i større væv, selv om Best1 synes at være ansvarlig for en komponent af ClCa i sensoriske neuroner31 og kan også være en vigtig regulator af calciumfrigivelse fra det endoplasmatiske retikulum32,33. Tre uafhængige undersøgelser foreslog TMEM16A (også kaldet Ano1) som en kandidat til en vigtig komponent, om end ikke i sin helhed, for en calciumaktiveret kloridkanal34-36. Mange efterfølgende undersøgelser, der er blevet lettet af genereringen af molekylære værktøjer, har støttet dette. TMEM16A er vigtig for regulering af membranens excitabilitet i vaskulær glat muskulatur, er opreguleret i en dyremodel af pulmonal hypertension, og tonen kan reduceres ved kanalhæmning37,38. I sensoriske neuroner kobler TMEM16A tilstedeværelsen af inflammatoriske mediatorer til membranhyperexcitabilitet, og TMEM16A-hæmning har antinociceptive virkninger39. I dyremodeller af astma er ekspressionen af denne særlige kloridkanal øget, og dens hæmning kan have gavnlige virkninger40. Den findes også i interstitielle Cajal-celler i tarmen, og kanalfunktionen er nødvendig for den rytmiske sammentrækning af glat muskulatur i tarmvæggen41. Desuden kan TMEM16A-aktivering give en alternativ vej for epithelial kloridsekretion ved cystisk fibrose42. Mens der stadig er en vis debat om den præcise funktion af resten af TMEM16-familien, er ClCa-funktionen også blevet tilskrevet TMEM16B (Ano2), som menes at ligge til grund for ClCa-kanalen i olfaktoriske hårceller43,44. Der kan også være roller for denne klasse af ionkanaler i kræftcellers biologi, og dens hæmning kan forhindre celleproliferation45-48.

Slutbemærkninger

Denne gennemgang har fremhævet de forskellige roller, som kloridledende eller -transporterende proteiner spiller, og hvordan deres dysfunktion er koblet til menneskelige lidelser eller sygdomslignende symptomer i dyremodeller. Der er en alvorlig mangel på farmakologiske reagenser, der hæmmer, aktiverer eller forbedrer membrantrafikken af kloridkanaler og transportører. Der gøres fremskridt med lægemidler, der omvender CFTR’s defekte funktion ved cystisk fibrose, hvilket forhåbentlig vil resultere i lægemidler, der er specifikke for de forskellige typer af arvelige mutationer. Inhibitorer og aktivatorer af TMEM16A-kalciumaktiverede kloridkanaler42,49 viser sig at være nyttige laboratorieværktøjer, og nye forbindelser kan udgøre effektive lægemidler, især hvis de kan give vævsspecifikke virkninger. Molekyler, der er specifikke for bestemte CLC’er, er sandsynligvis de mest vanskelige at finde. En forståelse af det strukturelle grundlag for aktivering af spændingsaktiverede CLC’er50 kan måske identificere proteindomæner, der kan målrettes ved rationel strukturbaseret lægemiddeldesign. Sådanne værktøjer vil gøre det muligt for os at afprøve nogle af de nye terapeutiske idéer, der er blevet gennemgået og præsenteret her.

Author Biography

Dr Jon Lippiat afsluttede sin ph.d. om kaliumkanalers struktur, funktion og farmakologi ved University of Leicester. Han studerede pancreasbetacellens funktion og diabetes ved University of Oxford, inden han blev ansat som lektor i farmakologi ved University of Leeds. Hans forskning går ud på at klarlægge de strukturelle og fysiologiske egenskaber af flere forskellige typer ionkanaler og transportører og deres potentielle målretning med nye farmakologiske reagenser.