Abstract
Tidligere undersøgelser har vist, at kolinforsyning er direkte forbundet med fedtholdig kost-induceret fedme og insulinresistens hos mus. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere, om kolintilførsel også kunne modulere fedme og insulinresistens forårsaget af en genetisk defekt. Otte uger gamle ob/ob-mushanner blev i to måneder fodret med enten kolinmangel- eller kolintilskuddet kost i to måneder. Vævsvægten, herunder fedtmasse og muskelmasse, blev vurderet. Intracellulær signalering, plasmaglucagon og insulin samt glukose- og insulintolerancetest blev også undersøgt. Den cholinfattige diæt bremsede kroppens vægtøgning og mindskede fedtmassen. Cholinmangel sænkede også plasmaglukoseniveauet og forbedrede glukose- og insulintolerancen, selv om fedtleveren blev forværret. Der blev også observeret øget fedtlipolytisk aktivitet, nedsat plasmaglukagon og nedsat ekspression af hepatisk glukagonreceptor ved cholinmangeldiæt. Vores resultater viser, at en cholin-deficient diæt kan mindske fedtmassen og forbedre glukosetolerancen hos overvægtige og diabetiske mus forårsaget af en genetisk defekt.
1. Indledning
Kolin er en vigtig kostfaktor, som er involveret i nogle afgørende processer såsom biosyntesen af neurotransmitteren acetylcholin og den vigtigste membrankomponent fosfatidylcholin (PC) . PC kan syntetiseres enten via CDP-cholinvejen eller via methylering af fosfatidylethanolamin ved hjælp af fosfatidylethanolamin N-methyltransferase (PEMT). PEMT-vejen er kun kvantitativt betydningsfuld i leveren . Cholin er også en vigtig forløber for neurotransmitteren acetylcholin, som virker gennem muscarin- og nikotinacetylcholinreceptorer. I de seneste år er det blevet klart, at der muligvis er en sammenhæng mellem cholin og fedme/diabetes . Det er blevet foreslået, at muscarinacetylcholinreceptorer kan være et terapeutisk mål for fedme . For nylig fandt vi, at PEMT-mangel kunne beskytte mus mod fedtholdig diæt-induceret fedme og insulinresistens . Denne beskyttelse forsvandt imidlertid, når der blev tilsat en høj dosis cholin til den fedtholdige diæt . PEMT-vejen efterfulgt af PC-katabolisme er den eneste kendte biosyntetiske vej for cholin hos pattedyr . Der blev fundet et betydeligt fald i kolinindholdet i flere væv hos PEMT-deficiente mus (Li et al., upublicerede data), hvilket giver en direkte forbindelse mellem kolin og fedtholdig diæt-induceret fedme/insulinresistens. I den aktuelle undersøgelse fodrede vi ob/ob-mus med en kolinmangeldiæt (CD) for at vurdere, om kolinmangel også kunne modulere genetisk afledt fedme og insulinresistens.
2. Materiale og metoder
2.1. Dyr og kost
Alle procedurer blev godkendt af University of Alberta’s Institutional Animal Care Committee i overensstemmelse med retningslinjerne fra det canadiske råd for dyrevelfærd. 8 uger gamle han ob/ob-mus af typen ob/ob-mus fra The Jackson Laboratory blev akklimatiseret i 1 uge. Der blev anvendt 5 mus i hver gruppe. Musene havde fri adgang til kolinmangel (CD) eller kolintilskud (CS) i 2 måneder. CD-diæten (MP Biomedicals Canada, katalog nr. 901387) indeholdt 20 % fedt i form af svinefedt. CS-diæten bestod af CD-diæten, som blev tilsat 0,4 % (w/w) cholinklorid. Musene blev ofret ved bedøvelse med isofluran, efterfulgt af hjertepunktion.
2.2. Kropsvægttilvækst, måling af lean masse og fedtmasse
Kropsvægten blev målt ugentligt. Den magre masse og fedtmassen blev analyseret, 2 måneder efter at musene var blevet sat på diæt (præmortem), ved hjælp af EchoMRI-systemet.
2.3. Glukose- og insulintolerancetest
Glukosetolerancetest: Efter 12 timers faste fik musene en intraperitoneal injektion (i.p.) af 0,5 g dextrose/kg kropsvægt opløst i steriliseret fosfatbufferet saltvand (PBS). Insulintolerancetest: Efter 6 timers faste fik musene i.p. en injektion af 1,0 enhed insulin (Sigma)/kg kropsvægt i PBS. Blodglukosekoncentrationerne blev målt med et glukometer i haleblod før og på de angivne tidspunkter efter injektionen.
2.4. Målinger af mitokondriel kompleks I/II-aktivitet
Aktiviteterne af mitokondriel kompleks I og II blev bestemt ved hjælp af mitokondrieprotein. Kort fortalt blev prøverne for at isolere mitokondrieprotein opbevaret på is og homogeniseret i en buffer indeholdende 75 mM saccharose, 225 mM sorbitol, 1 mM EGTA og 0,1% fedtsyrefri bovin serumalbumin i 10 mM Tris-HCl pH 7,4. Homogenatet blev centrifugeret ved 600× g i 15 min, og den resulterende supernatant blev yderligere centrifugeret i 20 min ved 16 200 rpm. Mitokondrieproteinet i pellets blev suspenderet i en buffer indeholdende 20 mM Tris og 25 mM saccharose (pH 7,4) og opbevaret ved -80 °C, indtil det blev anvendt. Aktivitetsmålingerne blev udført i et spektrofotometer i en periode på 5 min. som et fald i absorbansen ved 600 nm som følge af reduktionen af 2,6-dichlorphenol-indophenol (DCPIP) til ubiquinon-1 i tilstedeværelse af enten NADH (substrat for kompleks I) eller succinat (substrat for kompleks II) i overensstemmelse hermed. Reaktionen blev udført i nærværelse af antimycin og kaliumcyanid som inhibitor for kompleks III og kompleks IV. Rotenon, som inhibitor af kompleks I, blev også inddraget i reaktionsbufferen for kompleks II-aktivitet.
2.5. Histologi og immunoblotting
Til histologi blev leveren eller fedtpuderne dissekeret i 10 % formaldehyd i PBS, hvorefter der blev foretaget rutinemæssig farvning med hæmatoxylin og eosin. Til immunoblotting blev de resulterende supernatanter efter homogenisering og centrifugering ved 600× g af leverprøverne underkastet en bestemmelse af proteinkoncentrationen (BioRad) for at sikre, at en lige stor mængde proteiner blev indlæst på SDS-PAGE. Alle primære antistoffer mod hormonfølsom lipase (phospho-HSL/total HSL), phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PEPCK), acetyl-CoA-carboxylase (phospho-ACC/total ACC) og AMP-aktiveret proteinkinase (phospho-AMPK/total AMPK) er købt hos Cell Signaling. Antistoffer mod pyruvatdehydrogenase kinase isoenzym 4 (PDK4), glucagonreceptor blev anskaffet fra Abcam, men suppressor of cytokine signalering 3 (SOCS3) og PGC-1α blev anskaffet fra Santa Cruz Biotechnology. tublin eller actin blev anvendt som belastningskontrol til normalisering. Billedet blev analyseret ved hjælp af ImageJ software.
2.6. Plasma insulin- og glukagonmåling
Målingerne blev udført ved hjælp af et mus/rotte glukagon, insulin assay kit (Meso Scale Discovery) baseret på virksomhedens instruktioner.
2.7. Statistisk analyse
Data er vist som gennemsnit ± SD. Forskellene blev vurderet ved hjælp af studenters t-test. En værdi på 𝑃<0,05 blev betragtet som signifikant.
3. Resultater
Cholinfattig diæt bremsede signifikant kropsvægttilvæksten op til 2 måneder (figur 1(a)) uden at påvirke fødeindtagelsen (daglig fødeindtagelse 7,21 ± 1,23 g for CD-mus mod 7,39 ± 1,31 g for CS-mus, 𝑃>0,05). Der var signifikant forskel i startkropsvægt mellem de to grupper (30,42±1,70 g for CD-mus mod 26,3±2,26 g for CS-mus, 𝑃=0,01). Cholinmangel havde ingen indflydelse på vægten af hjerte, lever eller nyre (Figur 1(b)), men der var et signifikant fald i vægten af epididymalt og perirenalt fedt (Figur 1(c)). Yderligere analyse ved hjælp af magnetisk resonansbilleddannelse viste, at cholinmangel mindskede hele kroppens fedtmasse og alligevel øgede den magre masse, uanset om den blev udtrykt som absolut masse eller relativ procentdel i forhold til hele kroppens masse (figur 1(d)). Kolinmangel øgede ekspressionen af fosforhormonfølsom lipase i fedtvævet, en aktiveret form af enzymet (figur 1(e)). Cholinmangel ændrede på den anden side ikke fedtvævets morfologi (figur 1(f)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)(e)
(e)
(f)
Cholin-mangelfuld diæt dæmper kroppsvægtforøgelse og øger den adipøse lipolytiske kapacitet. 8 uger gamle han-ob/ob-mus havde fri adgang til enten CD- eller CS-diæt i 2 måneder. Kropsvægttilvækst (a), vævsvægt (b), epididymal og perirenal fedtvægt (c) samt fedtmasse og magert masse (d) blev målt. Proteinekspressionen af phospho- og totalhormonfølsom lipase i fedtvævet blev analyseret ved immunoblotting (e). Fedtpudeafsnittene blev farvet med H & E (f). ∗∗∗𝑃<0,01 og ∗∗𝑃<0,05 i forhold til CS-gruppen.
Udover at påvirke kropsvægten nedsatte cholinmangel også fastende plasmaglukose (14,3 ± 1,67 mod 10,8 ± 1,19, 𝑛=5, 𝑃<0,05) og glukagonniveauet (figur 2(a)), selv om det ikke havde nogen effekt på plasmainsulinniveauet (figur 2(b)). Der blev observeret en signifikant forbedret glukose- og insulinintolerance hos mus på cholin-deficient diæt (figur 2(c)-2(d)). For at undersøge den underliggende mekanisme blev de vigtigste enzymer for glukoseoxidation analyseret. Cholinmangel reducerede hepatisk proteinekspression af PDK4 (Figur 3(a)), en negativ regulator af pyruvatdehydrogenaseaktivitet, der kontrollerer tilstrømningen af mitokondrieacetyl-CoA, hvilket indikerer en forbedret glukoseudnyttelse. Tilsvarende blev hepatisk PGC-1α (en velkendt opstrømsmodulator af PDK4) og PEPCK (et nedstrømsmål for PGC-1 α og et nøgleenzym for glukoneogenese) reduceret (Figur 3(b)), hvilket tyder på en formindsket glukoneogenese. Desuden undersøgte vi, om den forbedrede glukose- og insulinintolerance kunne være forbundet med ændringen af hepatisk inflammation og mitokondriefunktion. Hverken proteinekspressionen af SOCS3 (Figur 3(c)), en markør for proinflammation, eller aktiviteten af mitokondriel citratsyntase blev påvirket (data ikke vist). Aktiviteten af mitokondrielt kompleks II, men ikke kompleks I, blev imidlertid signifikant nedsat ved mangel på cholin (figur 3(d)). Af interesse var proteinekspressionen af den hepatiske glukagonreceptor også nedsat ved cholinmangel (figur 3(e)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Cholin-mangelfuld kost forbedrer glukose- og insulinintolerance. 8 uger gamle han-ob/ob-mus havde fri adgang til enten CD- eller CS-diæt i 2 måneder. Niveauet af fastende plasmaglucagon (a) og insulin (b) blev målt. Der blev udført intraperitoneal glukosetolerancetest (c) og insulintolerancetest (d). ∗∗∗𝑃<0,01 og ∗∗𝑃<0,05 i forhold til CS-gruppen.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Molekylære mekanismer, der er involveret i forbedret insulinfølsomhed hos ob/ob-mus på cholin-mangelfuld diæt. 8 uger gamle han ob/ob-mus af typen ob/ob-mus havde fri adgang til enten CD- eller CS-diæt i 2 måneder. Hepatisk proteinekspression af PDK4 (a), PEPCK, PGC-1α (b), SOCS3 (c) og glucagonreceptor (e) blev analyseret ved immunoblotting. Aktiviteterne af mitokondrielt kompleks I og II blev også målt (d). ∗𝑃<0,05 sammenlignet med CS-gruppen.
Selv om det forbedrer glukosetolerancen, forværrer cholinmangel fedtleveren, understøttet af histologisk analyse og øget hepatisk triglyceridmasse (Figur 4(a)). For at forstå de mekanismer, der ligger til grund for cholinmangel-induceret fedtlever, undersøgte vi de enzymer, der er involveret i fedtsyre-β-oxidation og lipogenese. Kolinmangel øgede den hepatiske glycerol-3-phospho-acyltransferase (GPAT)-aktivitet (Figur 4(b)) og nedsatte aktiviteten af β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (β-HAD) (Figur 4(c)), et nøgleenzym for fedtsyre β-oxidation, hvilket indikerer, at flere intracellulære fedtsyrer blev kanaliseret til lipidbiosyntese snarere end til oxidation. Denne opfattelse blev yderligere understøttet af et fald i hepatisk phospho-AMPK- og phospho-ACC-ekspression (Figur 4(d)), som derefter aktiverer ACC og forbedrer hepatisk lipogenese.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Molekylære mekanismer, der er involveret i udviklingen af fedtlever hos ob/ob-mus på cholin-mangelfuld kost. 8 uger gamle han ob/ob-mus af hankøn havde fri adgang til enten CD- eller CS-diæt i 2 måneder. Leversektionerne blev farvet med H & E farvningsprotokol, og mængden af hepatisk triglycerid blev målt (a). Aktiviteterne af glycerol-3-fosfat-acyltransferase (GPAT) (b) og β-hydroxyl acyl-CoA dehydrogenase (β-HAD) (c) blev analyseret. Proteinekspressionen af phospho-AMPK og phospho-ACC blev overvåget (d). ∗𝑃<0,05 sammenlignet med CS-gruppen.
4. Diskussion
I tidligere arbejde har vi vist, at cholintilskud er forbundet med fedtholdig diæt-induceret fedme og insulinresistens i PEMT-deficiente mus . For nylig har vi fundet, at kolininduceret insulinresistens er kolinspecifik, ikke kun hos vildtype-mus, men også hos PEMT-deficiente mus (Wu og Vance et al. upublicerede data). I den aktuelle undersøgelse undersøgte vi virkningen af cholinberøvelse på ob/ob-mus. Vi påviste fem nye virkninger af cholinmangel: (1) øget adipøs lipolytisk aktivitet; (2) forbedret glukoseoxidation; (3) nedsat hepatisk fedtsyreoxidation; (4) nedreguleret hepatisk glukagonreceptorekspression; (5) reduceret hepatisk mitokondriel kompleks II-aktivitet.
4.1. Cholinmangel dæmper vægtøgning
Colinmangel dæmper signifikant fedtholdig diæt-induceret fedme hos Pemt-/- mus og vægtøgning hos ob/ob-mus. Raubenheimer et al. rapporterede imidlertid, at cholinmangel ikke påvirkede vægtøgning eller vægten af fedtvæv . Forskellen mellem de to undersøgelser kan skyldes forskelle i dyremodellerne og fodringsprotokollerne. I Raubenheimers undersøgelse blev C57Bl/6-musene fodret med enten fedtholdig eller fedtfattig kost i 8 uger, men musene fik kun CD- eller CS-diæt i de sidste 4 uger. Vores ob/ob-mus blev fodret med CD- eller CS-diæt med højt fedtindhold i 8 uger. I litteraturen er både han- og hunmus ob/ob-mus blevet anvendt i stor udstrækning i metaboliske undersøgelser, f.eks. af kropsvægttilvækst og hepatisk (og muskel-) insulinfølsomhed, og der er ikke rapporteret nogen signifikant kønseffekt. I vores undersøgelse blev der kun anvendt han ob/ob-mus.
Vores nuværende undersøgelse viser, at cholin også kan modulere genetisk afledt fedme. Da kolinmangel ikke påvirkede fødeindtagelsen, kan øget adipøs lipolytisk aktivitet (øget ekspression af aktiv hormonfølsom lipase) forklare reduceret fedtmasse og vægtøgning. Desuden kan vi ikke udelukke mulighederne for, at kolinmangel kan øge energiforbruget eller ekspressionen af UCP1 i brunt fedtvæv og UCP2/UCP3 i skeletmuskulaturen, hvilket er potentielle faktorer, der bidrager til nedsat vægtøgning .
4.2. Kolinmangel forbedrer glukosetolerance
I modsætning til kolintilskud, som er forbundet med fedtholdig diæt-induceret insulinresistens hos mus , forbedrede kolinmangel glukosetolerance hos ob/ob-mus. Dette er i overensstemmelse med Raubenheimers undersøgelse, hvor C57Bl/6 mus på en CD fedtholdig diæt havde nedsatte insulinniveauer og forbedret glukosetolerance sammenlignet med cholin suppleret fedtholdig diæt . Højt plasma glukagon findes normalt hos type 2-diabetiske patienter . Cholininjektion øgede både plasmainsulin- og glukagonniveauet hos rotter . Omvendt mindskede kolinmangel i vores undersøgelse plasma glukagon og nedsatte ekspressionen af glukagonreceptoren. Da glukagonreceptorantagonister i de seneste år er blevet foreslået som potentielle terapeutiske lægemidler til behandling af type 2-diabetes , kan den nedsatte proteinekspression af glukagonreceptoren hos ob/ob-mus på kolinmangeldiæt til en vis grad forklare den forbedrede glukosetolerance. Den nedsatte hepatiske PGC-1α-ekspression var ledsaget af en nedregulering af PEPCK og PDK4, hvilket indikerer en nedsat glukoseproduktion og øget glukoseoxidation. Nedregulering af β-HADH-aktivitet tydede på nedsat fedtsyreoxidation. Disse processer blev ledsaget af en nedsat mitokondriel kompleks II-aktivitet, hvilket kan afspejle et kompenserende svar på reduceret mitokondriel oxidativ stress. Således skyldtes CD-forbedret glukosetolerance en nedsat hepatisk glukoseproduktion og øget glukoseudnyttelse. Dette kunne ske gennem undertrykkelse af hepatisk glukagonreceptor, som regulerer AMPK via adenylatcyklase og derved modulerer PGC-1α og dets downstream-mål, såsom PEPCK og PDK4, samt hepatisk mitokondriel elektrontransportkapacitet. Der er således behov for yderligere undersøgelser for at bevise, om glukagonreceptoren kan være et nyt terapeutisk mål for diabetes.
4.3. Uforbindelsen mellem fedtlever og insulinresistens
Fedtlever har vist sig at være en fedmeuafhængig prædiktor for type 2-diabetes. Øgede intracellulære fedtsyrer menes at spille en kausal rolle i hepatisk insulinresistens . I den aktuelle undersøgelse forværrede kolinmangel fedtlever, hvor der blev observeret et fald i β-hydroxyacyl CoA dehydrogenaseaktivitet og en stigning i glycerol palmitoyl-acyl transferaseaktivitet, hvilket tyder på en rolle for cholin i modulering af fedtsyremetabolismen. Derfor kan omdirigering af fedtsyrer til hepatisk triglyceridlagring være en indledende beskyttende mekanisme til at sænke hepatiske intracellulære fedtsyrekoncentrationer. Langvarig kolinmangel er imidlertid forbundet med hepatosteatose, risiko for neuralrørsdefekt samt risiko for kræft og hukommelsestab , hvilket kan begrænse brugen af en kolinmangeldiæt som en langsigtet terapeutisk strategi for fedme og insulinresistens.
Sammenfattende kan kolinmangel forhindre vægtøgning og forbedre glukosetolerance hos ob/ob-mus. En beskeden begrænsning af indtagelse af fødevarer med højt indhold af cholin kan gavne fedme, prædiabetiske og diabetiske patienter. Vores resultater foreslår nye mulige terapeutiske tilgange.
Abkortninger
| PC: | Phosphatidylcholin |
| PEMT: | Phosphatidylethanolamin N-methyltransferase |
| CD: | Colinmangel |
| CS: | Colintilskud |
| HSL: | Hormonsensitiv lipase |
| PEPCK: | Phosphoenolpyruvatcarboxykinase |
| ACC: | Acetyl-CoA Carboxylase |
| AMPK: | AMP-aktiveret proteinkinase (AMPK) |
| PDK4: | Pyruvatdehydrogenase kinase isoenzym 4 |
| SOCS3: | Suppressor of cytokine signalering 3 |
| GPAT: | Glycerol-3-phospho-acyltransferase. |
Autors bidrag
G. Wu og L. Zhang bidrog ligeligt.
Author Disclosure
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling (MOP 89793) fra Canadian Institutes of Health Research.