Af de DNA-fragmenter, som vi oprindeligt forsøgte at amplificere, kun tlp2, che1P og cheA1 (tabel 1) producerede et PCR-amplifikationsprodukt uden brug af opløsningsmiddeltilsætningsstoffer, når genomisk DNA af A. brasilense blev anvendt som skabelon (figur 1). Først blev virkningerne af DMSO i koncentrationer på 1,25 %, 2,5 %, 5,0 %, 7,5 % og 10 % (w/vol) samt formamid i lignende koncentrationer som tilsætningsstoffer i PCR testet (figur 1). Der blev også udført et sæt PCR med BSA i koncentrationen 1-10 μg/μl (data ikke vist). I overensstemmelse med data fra litteraturen gav både DMSO- og formamidtilsætning i PCR et øget udbytte af amplifikation af DNA-fragmenter på 2-3 kb, men den forstærkende virkning af DMSO var større end af formamid (figur 1). Under disse betingelser observerede vi også, at en forøgelse af koncentrationen af DMSO også kunne føre til et fald i PCR-specificiteten (figur 2). På den anden side faldt virkningen af formamid med hensyn til at fremme et øget PCR-udbytte for DNA-fragmenter, der var større end ca. 2,5 kb (figur 1). Der var ingen signifikant virkning af at tilsætte BSA alene som et PCR-tilsætningsstof under disse betingelser, herunder ingen skadelig virkning (data ikke vist). De forbedrende virkninger af BSA på PCR-udbyttet blev påvist, når det blev anvendt i kombination med DMSO eller formamid over et bredt spektrum af DNA-fragmentstørrelser (figur 2). Desuden udvidede tilsætning af BSA intervallet af koncentrationer, for hvilke det organiske opløsningsmiddel kunne tilsættes, selv for DNA-templates af større størrelser (figur 2). Konsensus i den nuværende litteratur om formamid viser, at det er mest effektivt som et PCR-tilsætningsstof, når det anvendes i koncentrationer fra 0 til 5%, og at effektiviteten falder helt ved 10% . Vores resultater viser, at formamid i tilstedeværelse af BSA er effektivt i det mindste op til koncentrationer på 10 % og med DNA-skabeloner på op til 2,5 kb i størrelse (tlp2); det lykkedes dog ikke at fremme amplifikation af DNA-fragmenter af større størrelse (figur 1). Dette resultat er i overensstemmelse med den rapporterede virkning af formamid som værende mest effektiv for DNA-skabelonamplifikationer op til ca. 2,5 kb og understøtter yderligere den opfattelse, at DMSO og formamid forbedrede PCR-udbyttet ved forskellige mekanismer. Uanset disse forskelle syntes tilsætning af BSA til denne PCR yderligere at fremme og udvide de gavnlige virkninger, der blev set, når et af de to opløsningsmidler blev anvendt som et PCR-tilsætningsstof. I betragtning af de potentielle negative virkninger, som høje koncentrationer af organiske opløsningsmidler kan have på følsomme downstream-applikationer som f.eks. sekventering eller kloning, er den forstærkende virkning af BSA-tilsætning betydelig. For at få indsigt i, hvordan BSA kan virke som en co-enhancer sammen med DMSO eller formamid, analyserer vi effekten af tilsætningen af BSA på amplifikationsudbyttet over 10, 15, 20, 25 og 30 PCR-cyklusser. Denne analyse bekræftede, at tilsætning af DMSO eller formamid, men ikke BSA alene, til PCR fører til en stigning i udbyttet (figur 3). Når BSA blev anvendt som en co-enhancer sammen med DMSO eller formamid, kunne der kun påvises en stigning i udbyttet i de første 15 cyklusser for alle skabeloner (figur 3). Denne stigning varierede fra en stigning i udbyttet på 10,5 % (che1P) til en stigning i udbyttet på 22,7 % (cheA1) i løbet af de første 15 cyklusser. Endvidere blev det konstateret, at den effektive koncentration af BSA steg med størrelsen af det amplifierede DNA-fragment op til en maksimal BSA-koncentration (10 μg/μl), hvor der ikke blev påvist nogen yderligere stigning i udbyttet. Desuden blev der ikke observeret noget fald i udbyttet, selv med den største koncentration af BSA tilsat under disse betingelser (figur 4). Den cyklusbegrænsede forbedrende virkning af BSA på PCR-udbyttet tyder på, at dette protein kan blive denatureret over tid og dermed miste sin effektivitet. For at teste denne hypotese blev der opstillet en PCR, hvor DMSO eller formamid blev kombineret med BSA i den indledende reaktionsbuffer i de mest effektive koncentrationer, der blev bestemt ovenfor, og kørt i 10 cyklusser, inden der blev tilsat en frisk opløsning af BSA (0-10 μg/μl slutkoncentration). BSA-tilsætning blev gentaget over 30 PCR-cyklusser, og virkningen på udbyttet blev analyseret som beskrevet ovenfor. Der kunne påvises en vedvarende stigning i udbyttet, når BSA blev tilsat ved hver tiende PCR-cyklus: f.eks. blev der ved amplifikation af cheA1 opnået en stigning på næsten 75 % i PCR-udbyttet i forhold til det, der blev opnået med opløsningsmiddel alene (figur 4). De resultater, der er set i det, vi kalder “BSA PCR-trin”-metoden, er i overensstemmelse med den antagelse, at BSA-denaturering forårsager faldet i den udbytteforbedrende effekt efter den femtende PCR-cyklus. Kontrolforsøg, hvor der blev tilsat glycerol eller destilleret sterilt vand ved hver tiende cyklus, øgede ikke PCR-udbyttet, hvilket tyder på, at virkningerne af BSA ikke skyldes en ændring i reaktionsvolumenet eller at BSA effektivt virker som en molekylær crowder, en egenskab, der tilskrives nogle af virkningerne af glycerol i PCR . Selv om de nøjagtige mekanismer for den forbedrende virkning af BSA på PCR-udbyttet ikke er kendt, understøtter de data, der er opnået her og beskrevet i litteraturen, hypotesen om, at BSA kan stabilisere DNA-polymerasen og/eller modvirke de potentielle hæmmende virkninger af høje koncentrationer af organiske opløsningsmidler på DNA-polymeraseaktiviteten. Ved amplifikation af cheA4, det DNA-fragment med det højeste GC-indhold, der blev anvendt i denne undersøgelse (73 %), blev der opnået en forøgelse af PCR-udbyttet ved at tilsætte BSA såvel som DMSO til PCR’en, men der blev også påvist flere uspecifikke amplifikationsprodukter (figur 5). For at løse dette problem blev BSA PCR-trinsmetoden derefter anvendt i kombination med en “Touchdown”-PCR-protokol, som tidligere har vist sig at forbedre PCR-specificiteten . Denne metode gav et enkelt specifikt bånd og næsten en fordobling af det udbytte, der blev opnået ved anvendelse af “Touchdown”-protokollen plus organiske opløsningsmidler alene (stigning på 96 %) (figur 5). Disse resultater foreslog os også en måde at forbedre den relativt lave effektivitet ved at bruge hele plasmide site-directed mutagenesis-metoden beskrevet i QuickChange Stratagene Mutagenesis Kit (Stratagene) til at indføre mutation i nogle GC-rige DNA-skabeloner (her tlp2-genet, et 2,5 kb-fragment med 66% GC). Da vi brugte pUCtlp2 som skabelon til stedbestemt mutagenese sammen med mutagene primere designet til at indføre en enkelt baseparsubstitution inden for tlp2 (mutagene primere designet i henhold til producentens websted) og producentens protokol, var det 5,324 kb-fragment, der svarer til pUCtlp2, knap synligt (figur 5). Efter afslutning af mutageneseprotokollen i henhold til producentens anvisninger blev der enten ingen koloni eller et lille antal kolonier (i gennemsnit mindre end 5), som indeholdt forældreplasmider, der manglede den ønskede mutation, opnået. Denne type resultat, der er karakteriseret ved et ringe udbytte af mutagenese, er tidligere blevet anerkendt som en almindelig faldgrube ved denne metode . Når BSA blev suppleret med fremstillingsbufferen ved hvert femte trin, blev der imidlertid påvist et klart amplifikationsprodukt (figur 5). Efter afslutning af producentens protokol blev der opnået over 100 kolonier med 2/3 af dem, der bar den ønskede mutation (bestemt ved sekventering). Vi anvendte også BSA-PCR-trinnet i en overlapforlængelsesprotokol til at konstruere en chimær proteinfusion mellem et A. brasilense-gen (ATM, 650 bp) og det cyan fluorescerende protein (CFP) (720 bp). I overlap extension PCR-proceduren anvendes der først to sæt primerpar til at amplificere to DNA-fragmenter, der skal fusioneres, og som er fremstillet med en kort overlappende sekvens med hinanden. En tredje amplifikation anvender amplifikationsprodukterne fra de første reaktioner som skabeloner sammen med de yderste reverse- og forward-primere til at generere chimære konstruktioner . Amplifikationen af de to første DNA-fragmenter, ATM og CFP, var meget effektiv ved hjælp af standard-PCR-protokoller, og der kunne ikke opnås nogen væsentlig forøgelse ved at anvende BSA PCR Step-protokollen (Data ikke vist). Det andet PCR-trin med overlapning producerede imidlertid mange uspecifikke amplifikationsprodukter og kun lidt, hvis overhovedet noget, ønsket kimær amplikon (ATM-CFP; tabel 1) (figur 5). De uspecifikke amplifikationsprodukter forsvandt ved anvendelse af en “Touchdown”-PCR-metode, men den specifikke ønskede kimære amplicon forblev i meget lille mængde, som detekteret ved et meget svagt ATM-CFP-bånd på 1 370 bp (figur 5). Anvendelse af BSA PCR Step-metoden sammen med en “Touchdown”-protokol resulterede i en stigning på 72 % i udbyttet af ATM-CFP-chimær amplikon (figur 5). Efterfølgende kloning og sekventering bekræftede, at der er opnået det korrekte chimære konstrukt.
Effekter af DMSO og formamid på PCR-amplifikation af GC-rige skabeloner. Typiske eksempler på virkningerne af tilsætning af DMSO og formamid i forskellige koncentrationer på PCR-amplifikationen af 2-3 kb GC-rige DNA-skabeloner. A) Virkning af DMSO på PCR-amplifikation af che1P (øverst) og tlp2 (nederst) som observeret ved gelelektroforese af de samlede PCR-produkter. Gelerne blev farvet med ethidiumbromid og fotograferet. B) Effekt af formamid på PCR-amplifikation af che1P (øverst) og tlp2 (nederst) i sammenlignelige forsøg.
PCR-udbytteforbedrende effekt af BSA som anvendes som et co-additiv med organiske opløsningsmidler. Typiske eksempler på virkningerne af BSA som et co-additiv sammen med DMSO og formamid i forskellige koncentrationer på PCR-amplifikation af GC-rige DNA-skabeloner. A) Virkning af DMSO på PCR af che1P (venstre) og kombineret virkning af DMSO med 6 μg/μl BSA (højre), som observeret ved gelelektroforese af det samlede PCR-produkt. B) Effekter af formamid på PCR-amplifikation af che1P (venstre) og kombineret effekt af formamid med 6 μg/μl BSA (højre) i sammenlignelige forsøg.
Effekt af BSA-tilsætning som en co-enhancer med organiske opløsningsmidler på PCR-udbyttet. Stigningen i PCR-udbyttet er udtrykt i forhold til det PCR-udbytte, der er opnået uden noget tilsætningsstof. På alle paneler gælder følgende legende: rød linje, kun DMSO (7,5 %); grøn linje, kun formamid (2,5 %); lilla linje, DMSO (7,5 %) og BSA (6 μg/μl); lyseblå, formamid (2,5 %) og BSA (6 μg/μl). A) PCR-amplifikation af che1P (392 bp); B) PCR-amplifikation af tlp5P (798 bp); C) PCR-amplifikation af tlp2 (2,638 bp); D) PCR-amplifikation af cheA1 (3 389 bp); E) PCR-amplifikation af cheOP1 (7 103 bp).
Effekt af BSA som et co-additiv med organiske opløsningsmidler, når det tilsættes i mellemliggende trin af PCR. A) Effekten af BSA-tilsætning på PCR-udbyttet ved tilsætning hver tiende cyklus for DNA-fragmenter i et bredt størrelsesområde (392 bp til 7 103 bp); B) Repræsentativt eksempel på effekten af BSA-tilsætning på PCR-amplifikationen af cheA1 (3 389 bp) i tilstedeværelse af DMSO, som detekteret ved analyse af DNA-fragmenter, der er amplificeret ved gelelektroforese.
Effekt af BSA som et co-additiv med organiske opløsningsmidler i forskellige PCR-applikationer. A) Et repræsentativt eksempel på effekten af BSA-tilsætning (BSA Step) som en co-enhancer af DMSO-effekten på PCR-amplifikation af cheA4 i en “Touchdown”-PCR-protokol, som detekteret ved gelelektroforese. B) Et repræsentativt eksempel på virkningen af BSA Step-protokollen anvendt i site-directed mutagenesis (QuickChange site-directed mutagenesis, Stratagene) PCR-amplifikation af pUCtlp2, som detekteret ved gelelektroforese. C) Et repræsentativt eksempel på effekten af BSA Step-protokollen anvendt i en overlap extension PCR-applikation, der fusionerer ATM med CFP for at give ATM-CFP, som detekteret ved gelelektroforese.