Rajskub fik sin første rolle som en Oompa-Loompa i en teateropsætning af Willy Wonka & the Chocolate Factory, og hendes første hovedrolle var Raggedy Ann. I 1996 medvirkede hun i musikvideoer til sangene “The Good Life” af Weezer og “The New Pollution” af Beck.
Fra 1996-1998 havde hun en tilbagevendende rolle i HBO-serien The Larry Sanders Show som bookingassistent Mary Lou Collins.
Hendes mest bemærkelsesværdige rolle er CTU-systemanalytikeren Chloe O’Brian i 24, som hun kom til i 2003 i starten af seriens tredje sæson. Hendes karakter var et hit hos seere og kritikere og var en af de få skuespillere, der vendte tilbage i seriens fjerde sæson. Efter at have været en fast gæstestjerne i to sæsoner blev Rajskub et fast castmedlem i seriens femte sæson. Ved seriens afslutning var hun den kvindelige hovedrolle og havde kun Kiefer Sutherland overgået i toppen af rollelisten. Hendes karakter havde også æren af at sige de sidste ord i serien i sæson 8’s seriefinale. Rajskub og Sutherland optrådte kortvarigt som deres 24-karakterer i et afsnit fra 2007, “24 Minutes”, af den animerede serie The Simpsons på Fox. I august 2013 blev det annonceret, at hun ville genoptage sin rolle som Chloe O’Brian i den begrænsede serie 24: Live Another Day fra 2014.
Rajskub var en af de oprindelige medvirkende i Mr. Hun optrådte i Kelsey Grammers The Sketch Show på Fox Television, The King of Queens som en karakter ved navn Priscilla, og i adskillige film, herunder Mysterious Skin, Legally Blonde 2, Sweet Home Alabama, Dude, Where’s My Car? Man on the Moon, Punch-Drunk Love, The Anniversary Party, Firewall, Little Miss Sunshine, musikvideoer for Beck, Weezer og Sheryl Crow, samt som portræt af en blind kvinde i filmen Road Trip.
Rajskub var en del af en komisk duo (sammen med Karen Kilgariff) kaldet Girls Guitar Club. I 2006 havde hun en cameooptræden i “Partings”, finalen af 6. sæson af Gilmore Girls, hvor hun spillede en trobairitz, der ledte efter sit store gennembrud. (Rajskub havde tidligere optrådt i Gilmore Girls som den kvindelige hovedrolle i A Film by Kirk, en kortfilm, der blev lavet af karakteren Kirk Gleason). Hun har arbejdet frivilligt som skuespillerinde med Young Storytellers Program. Hun har en uddannelsesmæssig baggrund som maler, idet hun har gået på San Francisco Art Institute.
Rajskub er blevet nomineret to gange til en Screen Actors Guild Award; en gang i 2005 og igen i 2007 for Outstanding Performance by an Ensemble in a Drama Series (fremragende præstation af et ensemble i en dramaserie). Hun medvirkede som gæstestjerne i Flight of the Conchords-afsnittet “Prime Minister” som Karen, en Art Garfunkel-fanatiker. Hun gæsteoptrådte som “Gail the Snail” i et afsnit af It’s Always Sunny in Philadelphia med titlen “The Gang Gives Frank an Intervention” og gentog rollen i finalen af niende sæson, “The Gang Squashes Their Beefs”, og i sæson 13, “The Gang Beats Boggs”: Ladies Reboot”. I 2009 medvirkede hun også i filmen Julie & Julia i rollen som Sarah, en af Julie Powells nære veninder. I 2010 optrådte Rajskub med stand-up i John Oliver’s New York Stand Up Show. I juni 2010 optrådte hun i afsnittet “Lovesick” i anden sæson af den amerikanske serie Royal Pains.
Fra juli til oktober 2010 optrådte hun i sit soloshow, Mary Lynn Spreads Her Legs, på Steve Allen Theater i Los Angeles. Anmelder F. Kathleen Foley fra Los Angeles Times skrev “den muntre, vulgære titel opsummerer den overordnede tone, som ofte er luftigt obskøn”. Forestillingen, der er skrevet af Rajskub med hjælp fra instruktør/udvikler Amit Itelman, er inspireret af Rajskubs erfaringer med graviditet, fødsel og tidligt moderskab.
I januar 2011 medvirkede Rajskub som gæstestjerne i afsnittet “Our Children, Ourselves” i anden sæson af ABC’s Modern Family. I efteråret 2011 medvirkede Rajskub i den kortvarige sitcom How to Be a Gentleman. Ligeledes i 2011 begyndte Rajskubs webserie Dicki at blive vist på My Damn Channel. Dicki er baseret på en række personer, som Rajskub voksede op i og omkring Michigan. Titelfiguren er en 40-årig kvinde, der bor hjemme hos sine forældre, laver kunsthåndværk og tager sin kunst alvorligt. Dicki har været en af My Damn Channel’s mest succesfulde webserier til dato. Den første sæson sluttede i november 2011, men en anden sæson er i øjeblikket under udvikling. Rajskub optrådte i juni 2012-udgaven af Don’t Tell My Mother! (Live Storytelling), et månedligt showcase, hvor berømtheder deler sande historier, som de aldrig ville ønske, at deres mødre skulle vide. Hun er i øjeblikket vært for en podcast på Nerdist Network kaldet Kickin’ it Mary Lynn Style.
I 2013 medvirkede Rajskub i fjerde sæson af Arrested Development i en tavs, men vel modtaget rolle som Heartfire, en karakter Rajskub har sagt “taler fra hjertet, men bruger ingen ord”. Samme år medvirkede Rajskub også i webserien All Growz Up med Melinda Hill.
Rajskub optrådte i Ken Reids podcast TV Guidance Counselor den 27. marts 2015.
I august 2016 optrådte Rajskub på Edinburgh Festival Fringe i 24 Hours With Mary Lynn Rajskub, og den blev godt modtaget af fans og kritikere.
I 2017 optrådte Rajskub i den første sæson af Adult Swim-serien Dream Corp LLC, hvor hun spillede Patient 46 i afsnittet “Are You Down With OCD?”.
I 2018 optrådte Rajskub i Night School over for Kevin Hart, Tiffany Haddish, Rob Riggle, Taran Killam, Megalyn Echikunwoke, Al Madrigal, Anne Winters, Fat Joe og Keith David.
I 2021 udgav Rajskub en 49-minutters komediespecial med titlen Mary Lynn Rajskub: Live from the Pandemic; den kan lejes eller købes via flere video-on-demand-tjenester.