Diskussion
Kit-genet koder for en celleoverfladereceptor, c-Kit, (molekylvægt 145-160 kd), der tilhører immunoglobulin-genfamilien og bærer en iboende tyrosinkinaseaktivitet i sin cytoplasmatiske del. Interaktionen mellem c-Kit og dens ligand, steel factor, fører til receptor-dimerisering, kinaseaktivering og tyrosinfosforylering af cytoplasmatiske proteiner. c-Kit-genet udtrykkes på melanocytter, gametocytter, mastceller, hæmatopoietiske stamceller og interstitielle celler af Cajal. Kit tyrosinkinase-membranreceptoren er således essentiel for melanogenese, gametogenese og hæmatopoiese under den embryonale udvikling og i det postnatale liv.
c-Kit udtrykkes i melanoblaster under melanogenese fra det tidspunkt, hvor de forlader neuralkammen. Ekspressionen fortsætter under den embryonale udvikling . Det udtrykkes også i melanocytterne hos postnatale dyr. Mutationer i murin-Kit-genet manifesterer sig således som dominerende hvide pletter (W). Ud over Kit-genet kan flere andre gener, f.eks. Pax3, Mitf og Sox10, også være involveret i fænotypen med hvide pletter. Mutationer i disse gener er forbundet med defekter i melanocytudviklingen . W-mutationer ændrer enten kodningssekvensen af Kit-receptortyrosinkinasen, hvilket resulterer i en receptor med nedsat kinaseaktivitet, eller de påvirker Kit-ekspressionen. W-mutationer, der påvirker Kit-ekspressionen, er ofte placeret i den regulatoriske sekvens. F.eks. påvirker KitW-57J-allelen det tidsmæssige og rumlige mønster af Kit-ekspressionen, således at KitW-57J/KitW-57J-musene har et uregelmæssigt bånd af pletter, mangler pigmentering i fødder og hale og har en hovedplet. KitW-57J-allelen omfatter en 80 kb-deletion i 5′-enden af den Kit-kodende sekvens . KitW-bd- og KitW-sh-allelerne påvirker også Kit-ekspressionsmønstret i udviklingsfasen, og både KitW-bd/+ og KitW-sh/+-musene viser et hvidt bånd i bagkropsregionen , . Begge alleler er forbundet med en genomisk inversion i 5′-regionen af Kit-genet . Disse resultater tyder på, at dysregulering af Kit-ekspressionen påvirker udviklingen af melanoblaster, og at der derved opstår hvide pletter i mutantmusene.
Vi fandt indsættelse af ERV-sekvensen i intron 1 af Kit-genet hos rotte. ERV-sekvenser er resultatet af både gamle og moderne infektioner af eksogene retrovirus, som med succes har koloniseret kimlinjen hos deres vært . ERV-indsættelsen forstyrrer værtens proteinkodende gener eller ændrer genekspressionen ved at påvirke splejsning eller ved at tilvejebringe nye signaler til initiering, regulering eller afslutning af transkriptionen . ERV-indsættelser af det første intron med antisense-orientering fører til et lille og lavere niveau af transkriptioner eller aberrant splejsning i musemutanter. Vi mener således, at den ERV-indsættelse, vi fandt i hooded-allelen, kan fremkalde en dysregulering af Kit-ekspressionen og dermed forårsage det specifikke hooded-mønster.
Vi fandt også den ensomme LTR-sekvens i den irske allel. Hos mus er det kendt, at den interne ERV-sekvens slettes via homologe rekombination mellem 5′ og 3′ LTR’erne, således at der efterlades en solitær LTR . En sådan deletion vender mutantfænotypen om til vildtypen eller svækker lejlighedsvis mutantfænotypen. Sidstnævnte tilfælde ses ved omvendelse af musen nonagouti (a) til black-and-tan (at) eller white-bellied agouti (Aw). a-indsættelsen består af et 5,5 kb VL30-element, som har inkorporeret 5,5 kb ekstra sekvens internt; denne interne sekvens er flankeret af 526 bp direkte gentagelser. Homolog rekombination, der udnytter de 526-bp direkte gentagelser, genererer at-allelen, der kun indeholder VL30-elementet med en enkelt intern 526-bp gentagelse. Homolog rekombination ved hjælp af VL30 LTR’erne frembringer Aw-allelen, som kun indeholder et enkelt LV30 LTR . Den irske rotte (hi) forårsager en hvid plet på maven mellem og bag forbenene. Vi konkluderer derfor, at den ensomme LTR i den irske allel også kan være blevet genereret ved homolog rekombination mellem 5′ og 3′ LTR’erne i rotte ERV, der er indsat i den hættetrøjeallel, og at den irske allel er en delvis revertant af den hættetrøjeallel på grund af den resterende ensomme LTR.
Pelsfarvevariationer har historisk set spillet en vigtig rolle i genetiske undersøgelser for at forstå de grundlæggende arvelighedsprincipper. Identifikationen af den forårsagende mutation for farvevariationer efterfulgt af en undersøgelse af dem for eksisterende stammer giver således indsigt i oprindelsen af pelsfarvemutationer. Da pelsfarvevariationer blev konstateret i de tidlige dage af rotternes domesticering, kan en sådan molekylærgenetisk tilgang give ny indsigt i etableringen af laboratorie rottestammer. I den foreliggende undersøgelse fokuserede vi på de ældste farvevariationer hos rotte, albino og hooded.
Vi indsamlede væv eller DNA fra rottestammer fra hele verden for at dække alle mulige albino- eller hooded-mutationer, der stadig findes i laboratorieråttestammer. Det forekommer således meget sandsynligt, at alle albino-laboratorierotterstammer, der er udviklet indtil nu, kun har én fælles mutation: 299His i Tyr-genet. De fleste eksisterende albino-rottestammer stammer fra albino-stammer eller -bestande fra Wistar-instituttet eller fra krydsninger mellem Wistar-albinorotter og andre rotter, herunder vilde rotter. De resterende albino-rotter stammer ikke direkte fra Wistar-instituttet (tabel S1). DON-stammerne, Iharas rottestammer og TO-stammerne blev etableret i Japan, mens F344-stammerne og HTX-stammen blev etableret i USA, og Yagils rottestammer blev etableret i Israel. De bærer også den samme Tyr-mutation. Disse resultater tyder på, at arveligheden af alle albino-rotter kan spores tilbage til én rotte med albino-mutationen.
Dertil kommer, at vi fandt, at alle de undersøgte albino-stammer uden undtagelse deler den 7.098-bp ERV-indsættelse i Kit-genet. Ifølge Donaldson , må der have været både albino- og hættebestande før etableringen af Wistar-albinostammen. I betragtning af de ensartede genotyper for albino- og hooded-mutationerne i albino-rottestammerne foreslår vi to mulige scenarier for etableringen af albino- og hooded-stammerne. Det mest sandsynlige er, at albino-mutationen opstod i en rotte fra en hættetrøjebestand. Fra denne koloni blev de første albino-rotter opdaget og brugt som grundlæggere af albino-rotter. Nogle albino-rotter blev indsat på Wistar-instituttet, og nogle blev brugt til udvikling af Wistar-uafhængige albino-stammer (fig. 4). Et andet scenarie er, at albino rottestammer var blevet udviklet uafhængigt af hættebestanden, og at der efterfølgende skete krydsninger mellem albino- og hættebestanden. I de resulterende bestande fra denne krydsning skal der være albino-rotter, som enten bærer hooded- (h) eller self-allelen (H). På baggrund af beviserne i denne undersøgelse blev albino-rotter med den særlige genotype (h/h, c/c) “tilfældigt” udvalgt og anvendt til at etablere albino-rottebestanden. Denne nyetablerede albinobestand blev indført i Wistar-instituttet, og nogle af rotterne blev anvendt til udvikling af Wistar-uafhængige albinobestande (fig. 4). Da vi ved vores undersøgelse ikke kunne påvise nogen albino-rotte uden ERV-indsættelse med hætte, forekommer det andet scenario meget usandsynligt og er kun af hypotetisk karakter. Derfor er det meget sandsynligt, at hættetrøjebestanden var blevet udviklet tidligere end albino-stammerne, og at rotte-albino-missense-mutationen opstod i én hættetrøje.
- PowerPoint-slide
- større billede
- større billede
- originalbillede
Scenarie 1: Mutationen for albino-rotte (299His) er opstået hos en rotte af hættetræsrottestammen (piebald). Fra denne stamme blev albino-stammen oprettet. Derefter blev de introduceret i Wistar-instituttet, og nogle albino-rotter blev anvendt til etablering af Wistar-uafhængige bestande. Scenario 2: Den albino-besætning, der kan spores tilbage til en albino-rotte, som var bærer af 299His-mutationen, og den hooded (piebald)-besætning blev etableret uafhængigt af hinanden. Der skete krydsning mellem albino- og hættetrøjebestandene. I de resulterende bestande fra denne krydsning skal der være albino-rotter, der enten bærer hooded (h) eller self (H) allelen, til stede. De albino-rotter med den bestemte genotype (h/h, c/c) blev “tilfældigt” udvalgt og anvendt til at etablere albino-rottebestanden. En sådan nyetableret albinobestand blev indført i Wistar-instituttet, og nogle rotter fra den blev anvendt til udvikling af de Wistar-uafhængige albinobestande.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043059.g004