4.3. Nikotinreceptorens struktur
Nikotinreceptoren i det elektriske organ og hvirveldyrs skeletmuskulatur er en pentamer, der består af fire forskellige underenheder (a, b, g og d) i det stoikiometriske forhold 2:1:1:1:1, henholdsvis. I modne, innerverede muskelendeplader er g-underenheden erstattet af e, en nært beslægtet underenhed. De enkelte underenheder er ca. 40 % identiske i deres aminosyresekvenser og stammer fra et fælles primordialgen. Den nikotiniske receptor blev prototypen for andre pentamere ligand-gated ionkanaler, som omfattede receptorerne for de hæmmende aminosyrer (g-aminosmørsyre og glycin) og visse serotoninreceptorer (5-HT3). Hver af underenhederne i den pentameriske receptor har en molekylmasse på 40 000 til 60 000 dalton. De 210 amino-terminale rester udgør stort set hele det ekstracellulære domæne. Dette efterfølges af fire transmembran-spanende (TM) domæner; området mellem det tredje og fjerde domæne udgør det meste af den cytoplasmatiske komponent. Hver af underenhederne i den nikotiniske ACh-receptor har en ekstracellulær og en intracellulær eksponering på den postsynaptiske membran. De fem underenheder er arrangeret omkring en pseudosymmetrisk symmetriakse for at omskrive en internt placeret kanal.
Receptoren er et asymmetrisk molekyle (14 nm×8 nm) på 250 000 dalton, hvor hovedparten af det ikke-membranoverskridende domæne er på den ekstracellulære overflade. I krydsningsområder (dvs. den motoriske endeplade i skeletmuskulaturen og den ventrale overflade af det elektriske organ) er receptoren til stede i høje tætheder (10 000/mm2) i en regelmæssig pakningsrækkefølge. Denne ordening af receptorerne har gjort det muligt at rekonstruere dens molekylære struktur ved hjælp af elektronmikroskopiske billeder. Et ACh-bindende protein, der kun er homologt med det ekstracellulære domæne af den nikotiniske receptor, er blevet identificeret i ferskvands- og saltvandssnegle og karakteriseret strukturelt og farmakologisk.
Dette protein samles som en homomer pentamer og binder nikotiniske receptor-ligander med den forventede selektivitet; dets krystalstruktur afslører en atomar organisation, der forventes af den nikotiniske receptor. Desuden giver fusionen af det ACh-bindende protein og receptorens transmembranspændinger et funktionelt protein, der udviser den kanal- og tilstandsændring, der forventes af receptoren. Dette bindingsprotein tjener både som et strukturelt og funktionelt surrogat af receptoren og har givet en detaljeret forståelse af de determinanter, der styrer nikotinreceptorens ligandspecificitet. De agonistbindende steder findes ved underenhedens grænseflader, men i muskler har kun to af de fem underenhedsgrænseflader, a g og a d, udviklet sig til at binde ligander. Bindingen af agonister, reversible kompetitive antagonister og elapid a-toksinet er gensidigt udelukkende og involverer overlappende overflader på receptoren. Begge underenheder, der udgør underenhedsgrænsefladen, bidrager til ligandspecificiteten. Målinger af membranens konduktans viser, at iontranslokationen er tilstrækkelig hurtig (5×107 ioner pr. sekund) til at kræve iontranslokation gennem en åben kanal snarere end ved hjælp af en roterende ionbærer. Desuden sker agonistmedierede ændringer i ionpermeabiliteten (typisk en indadgående bevægelse af primært Na+ og sekundært Ca2+) gennem en kationkanal, der er indbygget i receptorstrukturen. Den anden transmembran-spændende region på hver af de fem underenheder danner kanalens indre omkreds. Agonistbindingsstedet er tæt forbundet med en ionkanal; i muskelreceptoren resulterer den samtidige binding af to agonistmolekyler i en hurtig konformationsændring, der åbner kanalen. Både bindings- og åbningsreaktionen viser positiv samarbejdsvilje. Nærmere oplysninger om kinetikken af kanalåbning har udviklet sig fra elektrofysiologiske patch-clamp-teknikker, der skelner mellem de enkelte åbnings- og lukningsbegivenheder for et enkelt receptormolekyle, og bekræfter, at nikotinacetylcholinreceptorer (nAChR) er pentamere ligandregulerede ionkanaler, som består af underenheder, der består af et ekstracellulært domæne, som bærer ligandbindingsstedet, og et særskilt ionporedomæne. Signaltransduktionen skyldes den allosteriske kobling mellem de to domæner, idet afstanden fra bindingsstedet til poredomænets gate er 50 Å. Receptorbindingsundersøgelser er imidlertid specifikke for nikotiniske cholinerge receptorer, som er blevet udført på isolerede vestibulære epitelier fra frøerne Rana catesbiana og Rana temporaria. Der fremlægges beviser for tilstedeværelsen af nikotinlignende kolinerge receptorer, der er specifikt forbundet med de sensoriske områder, og der er undersøgt binding af atypiske nikotinagonistkonformiteter, som giver subtypeselektivitet, og det konkluderes, at nAChR spiller en afgørende rolle i excitatorisk neurotransmission og er et vigtigt mål for lægemidler og insekticider. Forskellige nAChR-subtyper med forskellige underenhedskombinationer, der giver differentiel selektivitet for nikotiniske lægemidler, og også identificeret en familie af gener, der koder for proteiner, der er homologe med α-underenheden af den nikotiniske acetylcholinreceptor i musklen, i rottegenomet. Disse gener transskriberes i det centrale og perifere nervesystem i områder, som vides at indeholde funktionelle nikotiniske receptorer. Den rolle, som β2-holdige neuronale nikotinreceptorer (nAChR’er) spiller i formidlingen af nikotins bivirkninger hos fosteret og den nyfødte. Gravide WT- og mutantmus, der mangler β2 nAChR-underenheden, blev implanteret med osmotiske minipumper, der afgav enten vand eller en kontrolleret dosis nikotin. Efterfølgende var der en sammenligning af udviklingen af det sympathoadrenale system og åndedræts- og vækkelsesreflekser hos afkommet kort efter fødslen, en periode med øget sårbarhed over for nikotineksponering. På den anden side er neonicotinoider, som imidacloprid, nAChR-agonister med potent insekticidaktivitet. Siden introduktionen i begyndelsen af 1990’erne er imidacloprid blevet et af de mest udbredte insekticider til både afgrødebeskyttelse og dyresundhedsmæssige formål, det molekylære grundlag for imidaclopridresistens, fem nAChR-underenheder (Nlα1-Nlα4 og Nlβ1) er blevet klonet fra Nilaparvata lugens. En sammenligning af generne for nAChR-underenheder fra imidacloprid-følsomme og imidacloprid-resistente populationer har identificeret en enkelt punktmutation på en bevaret position (Y151S) i to nAChR-underenheder, Nlα1 og Nlα3. Der er blevet påvist en stærk sammenhæng mellem hyppigheden af Y151S-punktmutationen og graden af resistens over for imidacloprid ved allel-specifik PCR. Ved ekspression af hybride nAChR’er, der indeholder Nilaparvata lugens α- og rotte β2-underenheder, blev der opnået beviser, der viser, at mutation Y151S er ansvarlig for en væsentlig reduktion i den specifikke imidaclopridbinding. Denne undersøgelse giver direkte bevis for forekomsten af target-site-resistens over for et neonicotinoid-insekticid og undersøgt om karakteren af kation-π-bindingsstedet i den nikotiniske receptor og finder, at den nikotiniske acetylcholinreceptor er prototypen af den ligand-gated ionkanal. En række aromatiske aminosyrer er blevet identificeret som bidragende til agonistbindingsstedet, hvilket tyder på, at kation-π-interaktioner kan være involveret i bindingen af den kvaternære ammoniumgruppe i agonisten, acetylcholin. Konformationen af kolinerge molekyler ved nikotiniske nervereceptorer, og finder en korrelation af krystalstrukturanalyserne af de potente nikotiniske agonister acetylcholin, acetyl-α-methylcholin, lactoylcholin, 1,1-dimethyl-4-phenylpiperazin og nikotin gør det muligt at bestemme konformationen af kolinerge agonister, der er relevante for nikotiniske nervereceptorer. Ekspressionen af neurotransmitterreceptorer, der er kodet af mRNA’er isoleret fra tre humane gliomcellelinjer. Oocytter, der er injiceret med mRNA’er fra to glioblastomcellelinjer, viste ingen elektriske reaktioner på de forskellige testede neurotransmittere.
Modulation af nAChR ved stryknin finder, at stryknin er en potent og selektiv antagonist ved glycinreceptorer, som viste sig at hæmme muskulære (α 1β 1γ δ, α 1β 1γ og α 1β 1δ) og neuronale (α 2β 2 og α 2β 4) nikotiniske acetylcholinreceptorer (AcChoRs) udtrykt i Xenopus-oocytter. Stryknin alene (op til 500 µmol/L) fremkaldte ikke membranstrømme i oocytter, der udtrykker AcChoRs, men når det blev anvendt før, samtidig eller under superfusion af acetylcholin (AcCho), inhiberede det hurtigt og reversibelt den strøm, der blev fremkaldt af AcCho (AcCho-strøm). Oversættelse af eksogent messenger RNA, der koder for nAChR’er, producerer funktionelle receptorer i Xenopus-ocytter, i denne undersøgelse blev messenger RNA, der blev ekstraheret fra Torpedos elektriske organ, injiceret i Xenopus-ocytter. Dette førte til syntese og inkorporering af funktionelle acetylcholinreceptorer i oocyttens membran. Når de blev aktiveret af acetylcholin, åbnede disse Torpedoacetylcholinreceptorer i oocytmembranen kanaler, hvis ioniske permeabilitet lignede nicotinreceptorernes i andre celler.
Lokaliseringen af acetylcholinreceptorer (AChR) i overfladen af udviklende myogene celler i kyllingeembryoets forreste og bageste latissimus dorsi-muskler i forhold til innervationsprocessen er blevet undersøgt på ultrastrukturelt niveau ved hjælp af et peberrodsperoxidase-α-bungarotoxin-konjugat. Der blev fundet lokaliserede koncentrationer af AChR i små områder 0,1-0.4 µm i bredden på overfladen af myogene celler i 10-14 dage gamle muskler, og man har også undersøgt virkningerne af acetylcholin og stoffer, der efterligner eller blokerer dets fysiologiske virkninger, på koncentrationer af guanosin 3′:5′-cyklisk monofosfat (cyklisk GMP) og adenosin 3′:5′-cyklisk monofosfat (cyklisk AMP) i skiver af hjernebark, hjerteventrikel og ileum fra pattedyr. Acetylcholin og kolinomimetiske stoffer med overvejende muscarinisk virkning, såsom methacholin, bethanechol og pilocarpin, fremkaldte en stigning i koncentrationen af cyklisk GMP eller et lille fald i koncentrationen af cyklisk AMP i alle tre undersøgte væv.
De funktionelle egenskaber og den cellulære lokalisering af den humane neuronale α7 AcCho-receptor (α7 AcChoR) og dens L248T muterede (mut) form blev undersøgt ved at udtrykke dem alene eller som genfusioner med den forstærkede version af det grønt fluorescerende protein (GFP). Xenopus oocytter injiceret med wild-type, mutα7 eller de kimeriske underenheds-cDNA’er udtrykte receptorer, der udløste membranstrømme, når de blev udsat for AcCho. Som det allerede er kendt, aftager AcCho-strømme, der genereres af wtα7-receptorer, meget hurtigere end dem, der udløses af mutα7-receptorer. Samspillet mellem β2 nikotinreceptorer og dopaminveje i kontrollen af spontan lokomotion, og finder acetylcholin (ACh) er en kendt modulator af aktiviteten af dopaminerge (DAergic) neuroner gennem stimulering af nAChR’er. Underenhedssammensætningen og den specifikke placering af nAChR’er, der er involveret i DA-medieret lokomotion, er dog stadig ikke fastlagt in vivo. Mus, der mangler β2-underenheden af nAChR’er (β2KO), udviser påfaldende hyperaktivitet i det åbne felt, hvilket tyder på en ubalance i DA-neurotransmission. Men mutation inden for domæne M2 af den nikotiniske receptor konverterer 5-Hydroxytryptamin fra antagonist til agonist, undersøgelsen blev udført på virkningerne af 5-hydroxytryptamin (5HT) på homomeriske neuronale nikotiniske receptorer (nAcChoR) udtrykt i Xenopus oocytter efter injektion af cDNA, der koder for den vildtype kyllingeunderenhed. AcCho fremkaldte store strømme, der blev reduceret af 5HT på en reversibel og dosisafhængig måde med en halvhæmmende koncentration og en Hill-koefficient. Selv om undersøgelse af den kolinerge receptor hos cytotoksiske T-lymfocytter og kolinerge agonister har sensibiliserede lymfocytternes evne til at skade celler, der bærer de sensibiliserende alloantigener, er den kolinerge receptor hos den angribende lymfocytpopulation blevet undersøgt med farmakologisk manipulation af et in vitro-system, der kvantificerer den skade, der formidles af sensibiliserede angribende celler på målceller.