Abstract
Makrofager spiller en vigtig rolle i værtsforsvaret, ud over den stærke evne til at fagocytose patogener eller fremmedlegemer. De udfylder en række forskellige roller i immunregulering, sårheling og bevarelse af vævshomøostase. Makrofager er kendetegnet ved stor heterogenitet, som kan polariseres i mindst to store ekstremer, nemlig makrofager af M1-typen (klassisk aktivering), som normalt stammer fra monocytter, og makrofager af M2-typen (alternativ aktivering), som for det meste er de vævsresidente makrofager. Med udgangspunkt i sårhelingsprocessen i huden har tidligere undersøgelser dokumenteret, hvordan disse forskellige undertyper af makrofager deltager i vævsreparation og -omdannelse, mens makrofagenes mekanisme i tarmanastomoselæning endnu ikke er blevet fastlagt. Denne gennemgang opsummerer de aktuelt tilgængelige beviser vedrørende de forskellige roller, som polariserede makrofager spiller i det fysiologiske forløb af anastomoseheling og deres patologiske roller i anastomoselækage, som er den farligste komplikation efter gastrointestinal kirurgi.
1. Introduktion
Makrofager er myeloide immunceller, der spiller en central rolle i inflammation og værtsforsvar . Disse celler er kendetegnet ved den kraftfulde evne til fagocytose og er krediteret for at beskytte værten mod infektion gennem en proces, der kaldes “medfødt immunitet” . I de seneste år har makrofager i takt med den voksende dokumentation vist sig at være en af de mest alsidige celler. Deres roller er skiftet fra immune effektorceller, der udfører værtsforsvaret blot som “skraldemænd” til dominerende “instruktører” og “eksekutorer” til regulering af inflammatorisk respons, opretholdelse af vævshomøostase, deltagelse i sårheling og vævsremodellering .
Makrofager er aktivt involveret i sårhelingsprocessen, mens deres rolle i et særligt kirurgisk sår, også kendt som anastomosesår, endnu ikke er blevet fuldt ud fastlagt. Anastomose konstrueres efter fjernelse af gastrointestinal tumor eller tarmresektion af kirurger for at rekonstruere fortsættelsen af mave-tarmkanalen. En unormal heling af en anastomose kan udvikle sig til anastomoselækage (AL), der defineres som luminal indhold, der lækker fra en kirurgisk tarmforbindelse . Det er den farligste komplikation efter kolorektal kirurgi , fordi den er ansvarlig for op til 40 % postoperativ dødelighed, forlænget hospitalsindlæggelse og en stigning i sundhedsudgifterne på grund af behandling af sepsis og behovet for reoperation .
Fra et makroskopisk synspunkt omfatter årsagen til AL hovedsagelig kommunikation, infektion og helingsforstyrrelser . En detaljeret mekanisme på celleniveau er dog endnu ikke fastlagt på grund af den begrænsede dokumentation . I denne gennemgang, med udgangspunkt i heterogene populationer af makrofager og deres modsatrettede tendenser til polarisering, har vi en tendens til at diskutere de forskellige typer makrofagers roller i en begivenhedsløs anastomoselukning og deres patologiske roller i anastomoselækage.
1.1. Undertyper af makrofager
Makrofager eller mononukleære fagocytter var længe blevet anset for at stamme fra hæmatopoietiske stamceller (HSC’er). Det fremherskende dogme har hævdet, at alle makrofager stammede fra og også blev genopfyldt af monocytter . Men celler fra makrofagfamilien (celler i det mononukleære fagocytsystem) udviser en bemærkelsesværdig heterogenitet, både hvad angår deres morfologi og biologiske funktioner . Disse nye data har sat spørgsmålstegn ved den længe fastholdte opfattelse af “HSC-monocyt-makrofag”. Der er beviser for, at vævsresidente makrofager som Kupffer-celler i leveren, epidermale Langerhans-celler i huden og mikroglia i hjernen stammer fra en æggeblommesæk og kan persistere i voksne mus uafhængigt af HSC’er . Disse vævsresidente makrofager kan forny sig in situ, selv om de i visse situationer også kan suppleres af monocytter fra blodet. I modsætning til monocyt-afledte makrofager, som deltager i en antibakteriel proces under akut inflammatorisk respons, udtrykker vævsresidente makrofager forskellige funktionelle egenskaber og spiller en central rolle i opretholdelsen af vævsarkitektur, funktion og homøostase , og deres rolle i anastomoseløsning diskuteres yderligere nedenfor.
Diversiteten og plasticiteten blev anerkendt som kendetegn ved makrofager, hvilket bidrager til deres betydelige heterogenitet. Generelt kan polarisering af makrofager opdeles i to store ekstremer, dvs. den klassiske aktivering, som resulterer i makrofager af M1-typen (M1), og den alternative aktivering, som resulterer i makrofager af M2-typen (M2). Disse to typer makrofager udviser forskellige funktionelle fænotyper som reaktion på mikromiljøsignaler, f.eks. mikrobielle produkter, beskadigede celler og cytokiner fra aktiverede lymfocytter. Specifikt kan ligander af Toll-like receptorer (TLR’er) og interferon-γ (IFN-γ) få makrofager til at polarisere sig til makrofager af M1-typen; tværtimod får interleukin-4 (IL-4) og interleukin-13 (IL-13) makrofager til at polarisere sig til makrofager af M2-typen . En sådan forklaring illustrerer dog muligvis ikke fuldt ud alle de forskellige aktiveringsscenarier. Murray et al. foreslog, at der skulle være nogle andre undertyper mellem M1 og M2 , herunder M2a-undergruppen, der induceres af IL-4 og IL-13, M2b-undergruppen, der aktiveres af immunkomplekser (TLR’er), og M2c-undergruppen, der deaktiveres af glukokortikoider, transformerende vækstfaktor (TGF) eller interleukin-10 (IL-10) . Desuden er det også rapporteret, at der kan være en supplerende undertype af M2 (M2d), som udløses af TLR-agonister og adenosin . Det ser ud til, at makrofagernes polarisering bør betragtes som et fortsat spektrum, hvor to typer makrofager (M1 og M2) indtager de modsatte ender. En anden klassifikation af polarisering foreslået af Mosser og Edwards foreslog, at makrofager aktiveres til at danne tre populationer, der er ansvarlige for henholdsvis værtsforsvar, sårheling og immunregulering . Forfatterne klassificerede makrofager på grundlag af deres grundlæggende funktioner snarere end på grundlag af stimuli. I overensstemmelse med den tidligere diskuterede opfattelse af “M1-M2”-paradigmet er de fleste monocyt-afledte makrofager klassisk aktiveret og udtrykker M1-fænotypen, som udøver værtsforsvar; omvendt er vævsresidente makrofager hovedsageligt aktiveret i den alternative vej, som udtrykker M2-lignende karakteristika og bevarer vævshomøostase og opløsning af inflammation .
1.2. Rollen af polariserede makrofager i fysiologisk anastomoseløsning
Den føderale traktals væg indeholder fire lag (dvs. mucosa, submucosa, muscularis propria og serosa). I forbindelse med en klassisk end-to-end inverteret tarmanastomose forsvinder spalten mellem de to ender af mave-tarmkanalen ved at anbringe serosa, hvilket giver en barriere, der isolerer den sterile bughule mod luminalindhold og bakterier; desuden er dette lag vigtigt for at levere en matrix for fibroblaster . Submucosa består af blodkar, lymfekar, og nervefibre; dette lag er kilden til fibroblaster, der bliver aktive efter gastrointestinal kirurgi og begynder at deponere kollagen. De hæftede eller syede kollagenfibre i dette lag giver størstedelen af anastomosens trækstyrke ; derfor er submucosa af stor betydning for den anastomosale heling. Slimhinden spiller også en rolle med hensyn til at opretholde homøostase for at muliggøre helingsprocessen. En pulje af makrofager i den gastrointestinale slimhinde er den største pulje af vævsmakrofager i kroppen, og en langvarig fravær eller dysfunktion af makrofager forringer den anastomosiske heling .
Tvævsreparation og heling efter skade er blevet studeret i århundreder, men er fortsat forstået til et begrænset objekt, nemlig hud. Til forskel fra dette er heling af mave-tarmkanalen anatomisk skjult for inspektion, hvilket kun tillader kirurgen at bedømme operationens succes kun på patientens parametre for det generelle velbefindende . Der er nogle forskelle mellem huden og den anastomosale heling, herunder anatomi (f.eks. ingen tilsvarende anatomisk komponent af serosa i kutanvæv) og kollagen- og kollagenaseaktivitet . Der forekommer imidlertid en klassisk reaktion på skader i alle organer og væv. Det fysiologiske forløb af anastomoseheling kan også opdeles i tre overlappende, men adskilte faser, som omfatter inflammation, ny vævsdannelse og remodellering (figur 1) .
1.2.1. Inflammation
Ud over infektion af forskellige mikrobielle faktorer kan skader eller traumer, såsom kirurgisk slag, også føre til en ikke-patogen-associeret inflammation, som yderligere kan opdeles i det tidlige inflammatoriske respons og det sene . I den tidlige inflammatoriske fase rekrutteres neutrofile fra det cirkulerende blod til det lokale sårvæv (det anastomosiske område) i første omgang. Disse rekrutterede polymorphonukleære celler fjerner de lokale fremmedpartikler eller bakterier og undergår derefter apoptose eller nekrose. Derefter rekrutteres monocytter og differentieres til makrofager, som er stærkt fagocytiske. De fagocytter nedsatte neutrofiler og andre vævsrester for at beskytte mod yderligere vævsskader. I denne fase, som reaktion på patogen-associerede modificerende mønstre (PAMP’er) i en kontaminerende omstændighed eller skade-associerede modificerende mønstre (DAMP’er) i en steril omstændighed, aktiveres makrofager klassisk set og udtrykker M1-fænototypen . M1-makrofager frigiver høje koncentrationer af proinflammatoriske cytokiner såsom tumornekrosefaktor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) og interleukin-12 (IL-12), protease og reaktive oxygenarter (ROS) , som alle menes at være vigtige for aflivning af mikroorganismer og proinflammatorisk respons . M1-makrofager kan også producere kollagenase, et højaktivitetsenzym, der forårsager kollagennedbrydning, hvilket resulterer i lav anastomosestyrke tidligt efter dannelsen af en anastomose . I den sene betændelsesfase med overdreven fagocytose af apoptotiske neutrofile aktiverer de apoptotiske neutrofile β2-integriner på makrofager til at udtrykke den antiinflammatoriske mediator transforming growth factor (TGF) . I modsætning hertil blev produktionen af proinflammatoriske cytokiner som TNF-α og IL-1β hæmmet . Makrofagenes fænotype skifter således fra proinflammatorisk M1-lignende til antiinflammatorisk M2-lignende. Disse makrofager producerer cytokiner som IL-10 og lægger grunden til ny vævsdannelse ved at udskille andre vækstfaktorer som f.eks. vaskulær endotelial vækstfaktor (VEGF) . Da makrofager stimuleret med IL-10, TGF eller glukokortikoider in vitro polariseres til M2c-subtypen, der har ligheder med antiinflammatoriske makrofager , tyder det på, at antiinflammatoriske makrofager tilhører makrofager af M2c-typen og er i stand til at forstærke deres antiinflammatoriske respons ved at udskille IL-10 og TGF i et feedforward loop. Desuden blev det vist, at antiinflammatoriske makrofageres antiinflammatoriske og regenererende kapacitet er fuldstændig IL-10-afhængig i sterile miljøer, f.eks. i kirurgiske sår .
1.2.2.2. Ny vævsdannelse
I denne fase genererer makrofager, der er bosiddende i vævet eller rekrutteret fra perifert blod, kendt som profibrotiske makrofager, forskellige vækstfaktorer såsom TGF, platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor-2 eller insulinlignende vækstfaktor-1 . Blandt dem er TGF et profibrotisk cytokin, der virker på fibroblaster og aktiverer dem til at differentiere sig til myofibroblaster i sårvæv. Myofibroblaster producerer en masse af ekstracellulære matrixkomponenter (ECM), herunder kollagen og fibronectin, for at fylde vævsdefekten op. I mave-tarmkanalen kan kollagen også produceres af glatte muskelceller . Kollagensubtyperne i mave-tarmkanalen er kollagen I, III og V, sammenlignet med udelukkende kollagen I og III i huden . Ved hjælp af effektive kontraktile kræfter fra myofibroblaster kan brud på sårvæv bindes sammen og genopbygge deres integritet . I mellemtiden frigiver profibrotiske makrofager og aktiverede fibroblaster proangiogene faktorer som VEGF, som får endotheliale progenitorceller til at kravle mod sårvævet for at fremme dannelsen af nye kar (angiogenese). Invasion af kapillæret øger blodforsyningen til det lokale væv og letter den anastomosale heling. Endvidere viste undersøgelser af den helende colonslimhinde hos kaniner efter eksperimentel excision, at en overflod af mesenkymale celler i de helende tarmmuskellag ledsager kapillærinvasion; disse celler kan differentiere sig til glatte muskelceller og histiocytter, som menes at være ansvarlige for genetablering af glat muskelvæv . Profibrotiske makrofager, myofibroblaster og neokar udgør tilsammen granulationsvævet, som er det vigtigste fundamentale kompartment i det normale sårhelingsforløb . Disse profibrotiske makrofager er funktionelt klassificeret som M2a-lignende makrofager, fordi de kan induceres in vitro af IL-4 og IL-13 . Det er imidlertid ikke klart, om antiinflammatoriske og profibrotiske makrofager kan skelnes klart in vivo, og det ser ud til, at makrofagplasticitet skaber en blanding eller kontinuerlige variantskift under sårheling .
1.2.3. Remodeling
Remodeling af anastomose er en dynamisk modningsproces inden for helet væv, der er baseret på en balance mellem ECM-deposition og nedbrydning og vævsremodellering . En del af de vævsresidente makrofager, de såkaldte fibrolytiske makrofager, er afgørende for at opretholde denne dynamiske balance. De producerer matrixmetalloproteinaser som matrixmetalloproteinase-2 (MMP2), matrixmetalloproteinase-9 (MMP9), matrixmetalloproteinase-12 (MMP12) og matrixmetalloproteinase-19 (MMP19) for at nedbryde matrixmakromolekyler, dvs. kollagen, som er en af de vigtigste komponenter i ECM. Submucosa er et styrkelag i mave-tarmkanalen og består overvejende af kollagen, og remodellering af dette lag er afgørende for styrken af anastomosen. Afhængigt af MMP’er, der udskilles af fibrolytiske makrofager, omlejres og krydsbindes de oprindeligt deponerede kollagenfibre og remodelleres fra type III-kollagen til type I-kollagen; sidstnævnte er meget stærkere. Desuden regulerer fibrolytiske makrofager også nedbrydningen ved at syntetisere TIMP’er (tissue inhibitor of metalloproteinases), som kan hæmme MMP’ernes aktiviteter. Desuden er fibrolytiske makrofager ansvarlige for induktion af fibroblast-apoptose, efterfølgende fjernelse af apoptotiske celler og undertrykkelse af yderligere inflammation via IL-10-frigivelse . Fibrolytiske makrofager foreslås at blive klassificeret som M2c-lignende makrofager, som kan udløses in vitro af apoptotiske celler og IL-10 .
Så deltager makrofager i hele det fysiologiske forløb af anastomoseløsning. Blandt de tre hovedfaser af vævsreparation udtrykker makrofager forskellige fænotyper i de forskellige faser. Der findes mindst fire typer makrofager i en tilstand af normal vævsreparation: (1) proinflammatoriske makrofager, (2) antiinflammatoriske makrofager, (3) profibrotiske makrofager og (4) fibrolytiske makrofager. Hvis vi sorterer disse fire typer makrofager i henhold til “M1-M2”-paradigmet, kan proinflammatoriske og profibrotiske makrofager svare til henholdsvis M1-type og M2a-type makrofager. I mellemtiden hører både antiinflammatoriske og fibrolytiske makrofager sandsynligvis til makrofager af M2c-typen .
1.3. Makrofagenes rolle i anastomoselækage
Som vi tidligere har diskuteret i vores gennemgang, indeholder forekomsten af AL hovedsagelig tre faktorer: kommunikation, infektion og helingsforstyrrelser. Ved kommunikation forstås defekt i fordøjelseskanalen i det anastomoseområde, der forbinder de gastrointestinale lumina og bughulen. Infektion angiver bakteriel infektion på det anastomotiske sted. Helingsforstyrrelser omfatter alle stoffer, der forstyrrer en normal helingsproces som f.eks. hypoxi eller inflammation. Disse tre faktorer interagerer aktivt med hinanden: en faktor finder sted, og en responskæde, der består af alle faktorer, vil blive sat i gang, hvilket i sidste ende fører til AL. F.eks. fremkalder infektion et inflammatorisk respons på det anastomosestedet, hvilket forringer kollagenaflejringen , forstyrrer derefter den normale helingsproces og fører til en kommunikation mellem de intra- og extraluminale gastrointestinale vægge. Tværtimod gør kommunikationen det muligt for tarmindholdet (herunder bakterier) at bevæge sig ind i bughulen, hvilket forårsager intraabdominal infektion og efterfølgende forsinker helingen af anastomosen. Klinisk set betragtes kommunikation i et vist omfang som et makroskopisk klinisk resultat, mens infektion og helingsforstyrrelser er varige biologiske processer. For AL er makrofager hovedsagelig involveret i de to sidstnævnte mekanismer, hvilket også observeres i andre dårligt helede sår .
Anastomoseinfektion kan skyldes anastomosedehiscens (tarmindholdet lækker til den sterile bughule) eller præ-/intraoperativ kontaminering. Uanset årsagen til infektionen polariserer makrofager i det kontaminerende infektiøse miljø sig som nævnt ovenfor til M1-typen. I stedet for at støtte resistens over for intracellulære bakterier og kontrollere den akutte fase af infektionen er et overdrevent eller langvarigt M1-program imidlertid skadeligt for patienterne, hvilket er påvist ved akutte infektioner med Escherichia coli . E. coli som en resident flora i tarmen kan fremkalde en typisk M1-profil gennem genkendelse af lipopolysaccharider (LPS) af TLR4 . Klassiske aktiverede M1-type makrofager opregulerer ekspressionen af inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS), som er ansvarlig for dannelsen af nitrogenoxid (NO). NO blev først identificeret til at formidle arteriel vasodilatation og blev derefter fundet at have en rolle i værtens forsvar mod patogener . Desuden er det blevet beskrevet, at NO spiller en fremtrædende rolle i forbindelse med kollagenaflejring, fibrose og ardannelse . Høje niveauer af NO i sår, som ved infektion eller betændelse, svækker alvorligt sårets kollagensyntese . Nedsat kollagenaflejring svækker alvorligt den anastomosestyrke, hvilket kan føre til en mislykket anastomoselæsion. Derfor bidrager ukorrekt M1-polarisering af makrofager ved bakteriel infektion i bughulen til forekomsten af AL.
Makrofagernes rolle i lækage med helingsforstyrrelser er mere kompliceret. Under en normal tilstand indledes vævsreparation fra rydning af vævsrester og døde celler, effektiv fagocyttering af disse “vævsaffald” af makrofager, og er afgørende for rettidig opløsning af inflammation og vellykket heling. Ikke desto mindre er makrofagernes evne til at fagocytose alvorligt påvirket hos patienter med diabetes mellitus, som er blevet ældre eller har gennemgået kemoterapi, hvilket direkte fører til en ophobning af apoptotiske eller nekrotiske celler på anastomosestedet. Denne ophobning af døde celler forlænger den inflammatoriske fase, forstyrrer helingsprocessen og bringer inflammationsafviklingen i fare . Andre forstyrrelser såsom iskæmi eller hypoxi i anastomoserne bringer den anastomoseløsning alvorligt i fare . På celleniveau fører eksponering af makrofager for et anoxisk miljø til ekspression af proinflammatoriske cytokiner som IL-1β og TNF-α og cytotoksiske mediatorer som NO , hvilket tyder på, at hypoxi kan fremme makrofager til at polarisere sig til M1-fenotypen. Overdrevent aktiverede M1-makrofager opretholder proinflammatorisk respons og hindrer de efterfølgende trin i reparationsprocessen, der påvirker korrekt heling og remodellering af anastomose , og den relevante mekanisme er beskrevet ovenfor.
Baseret på de tilgængelige beviser ser det ud til, at klassisk aktiverede makrofager, der udtrykker M1-fænototypen, er ansvarlige for den patologiske proces med defekt anastomoseheling, mens alternativt aktiverede makrofager, der udtrykker M2-fænotypen, spiller en afgørende rolle i inflammationsløsning og vellykket vævsreparation (figur 2). Selv om makrofager af M1-typen deltager i den tidlige fase af normal sårheling, danner den programmerede transformation af deres polariserede orientering fra M1 til M2 grundlaget for det forbigående inflammatoriske respons og den efterfølgende vævsregeneration.
2. Konklusion
Makrofager er de mest alsidige immunceller og besidder en betydelig plasticitet og heterogenitet. Makrofager kan polarisere sig i to hovedekstremer og udtrykke tilsvarende fænotyper (M1 og M2). Da polarisering er forudsætningen for, at makrofager kan udøve deres forskellige biologiske funktioner, spiller forskellige polariserede makrofager forskellige roller i den fysiologiske proces med anastomoseløsning og i patogenese af AL. Ved at genforstå AL ud fra makrofagenes perspektiv kan man bidrage til udforskning af nye diagnostiske værktøjer og terapeutiske mål. For eksempel kan spektret af cytokiner og inflammatoriske mediatorer såsom IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, ROS og NO, som udskilles af makrofager, forekomme ændret i forskellige genopretningsfaser efter anastomosekonstruktion. Desuden kan niveauet af disse stoffer indirekte afspejle situationen for en anastomose. En unormal fluktuation af disse stoffer indikerer sandsynligvis en forstyrrelse og en afbrydelse af anastomosehelingen, hvilket kan betragtes som en forvarsel om AL. Da makrofager af M1-typen viser en stimulerende virkning på AL, og M2-makrofager er afgørende for anastomoseheling, kan regulering af M1/M2-polarisering finde sine terapeutiske roller i behandlingen af AL i fremtiden.
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.
Autors bidrag
Jinyao Shi og Zhouqiao Wu er førsteforfattere.
Anerkendelser
Denne artikel er støttet af Beijing Municipal Science and Technology Commission (nr. D141100000414004 og Z151100004015070) og Beijing Municipal Commission of Health and Family Planning (nr. 2014-1-2151).