RESULTATER
Identifikation af kandidatgener til regulering af dyrepoldomænet (APD)
For at definere den tidlige regulatoriske tilstand af APD i søpindsvinets embryo brugte vi samtidig både bioinformatiske og eksperimentelle metoder til at identificere gener, der koder for regulatoriske proteiner, som udtrykkes i detteterritorium før gastrulation. Den bioinformatiske tilgang udnyttede genomsekvensannoteringsindsatsen fra vores laboratorium (Burke et al., 2006) og fra andre (Howard-Ashby et al., 2006a; Howard-Ashby et al., 2006b; Materna et al., 2006; Tu et al., 2006), som dokumenterede APD-ekspressionsmønstre for mange gener, der kodede for transkriptionsfaktorer og/eller var ortologer af faktorer, der er kendt for at fungere i neuralt væv i embryoner af andre arter. Den eksperimentelle fremgangsmåde sammenlignede repræsentationen af RNA’er i Δcadherin mRNA-injicerede kontra normale embryoner i blastula-stadiet ved udklækningen. Embryoner, der mangler nukleært β-catenin, består næsten udelukkende af ektoderm fra dyrepolen, som det fremgår af ekspressionsmønstrene for foxq2 og hbn. I normale embryoner er disse mRNA’er begrænset til dyrepolen fra blastulastadiet (Burke et al., 2006; Tu et al., 2006; Tu et al., 2006; Yaguchi et al., 2008), og områderne for deres ekspression i mesenchym-blastulastadiet overlapper hinanden ved dyrepolen (Fig. 1B-D). Efterhånden som udviklingen skrider frem gennem gastrulation, danner domænet afhbn-eksprimerende celler en ring, der omgiver celler, der udtrykkerfoxq2 (Fig. 1F). Når den kanoniske Wnt-, Nodal- og BMP-signalering alle elimineres ved ΔcadherinmRNA-injektion, udtrykker den animalske halvdel af embryoet foxq2, mens det meste af den resterende del af embryoet udtrykker hbn (Fig. 1H). Disse mønstre viser, at embryoer, der mangler kanonisk Wnt- og Nodal-BMP2/4-signalering, næsten udelukkende består af en dramatisk udvidet APD, hvis ydre grænser er defineret af hbn-ekspression. Foxq2- og hbn-transskriptioner forekommer i APD i de sene spaltningsstadier/tidlige blastulastadier, hvilket indikerer, at specifikation af APD’en sker i det mindste på dette tidspunkt.
Δcadherin-misexpressende embryoner består af animal pole domain(APD)-væv, der er defineret ved ekspression af foxq2 og hbn.Helmount in situ-hybridiseringer på embryoner på mesenchym-blastula(A-D) og gastrulae (E-H) stadier. (E,F) Glycerol-injiceret kontrol. (G,H) Δcadherin-mRNA injiceret. (A,E,G) DIC; (B-D,F,H) To-farve-fluorescens, hbn (grøn) og foxq2 (magenta) RNA’er. Skala: 20 μm.
For at identificere tidlige APD-regulerende gener sammenlignede vi de relative koncentrationer af individuelle mRNA’er i Δcadherin mRNA- versus glycerol-injicerede embryoner på blastula-stadiet ved hjælp af et mikroarray, der repræsenterer alle genprædiktioner, der findes i søpindsvinets genomsekvens (Wei et al., 2006). Dette stadie markerer overgangen mellem spaltning og begyndelsen af morfogenese og er kort efter det tidspunkt, hvor de tidligste markører for APD er blevet påvist (Burke et al., 2006;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006b;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008). Der blev identificeret et sæt af gener, der kodede for transkriptionsfaktorer og komponenter af signalveje med en gennemsnitlig mindst 3 gange højere ekspression i to partier afΔcadherin mRNA-injicerede embryoner. Disse overlappede delvist med det sæt af kandidatgener, der blev identificeret ved den bioinformatiske metode. De kombinerede sæt indeholder 27 gener og udgør et foreløbigt, foreløbigt APD-regulerende gensæt (E-APD) (tabel 1).
- Se inline
- Se popup
Følsomhed af gener i E-APD-sættet over for tab af nukleærβ-catenin
For at identificere de tidligst udtrykte gener inden for E-APD-sættet undersøgte vi mikroarray-genererede tidsmæssige ekspressionsprofiler som tidligere beskrevet (Wei et al, 2006).Mønstre blev verificeret ved sammenligning med offentliggjorte data (Burke et al., 2006;Croce et al., 2006;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006b;Materna et al., 2006;Sweet et al., 2002;Takacs et al., 2004;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008) og ved vores helmonterede in situ-hybridiseringer (vores upublicerede observationer). Generne blev sorteret i tre grupper: dem, der var maksimalt repræsenteret i denaternale RNA-population (Fig.2A), dem, der var stærkt opreguleret under spaltningsstadier (Fig. 2B,C), og dem, der var opreguleret mellem sene spaltningsstadier og tidlige gastrulastadier (Fig. 2D). Vi fokuserede først på medlemmer af den tidlige embryonale ekspressionsgruppe. Som vist nedenfor identificerede vi ved hjælp af både tabs- og gain-of-function-assays én, Sp-Six3 (herefter Six3), som opererer i eller tæt på toppen af APD-generationsreguleringshierarkiet.
Six3 udtrykkes tidligt i APD
Identifikationen af søpindsvin six3 er entydig, fordi dens sekvens er meget stærkt konserveret i homeodomænet (98% identisk medHsSix3), six-domænet (91%) og groucho-interaktionsdomænet (71%) (seFig. S1 i det supplerende materiale). Vi bekræftede tidligere undersøgelser, der viser, at Six3 udtrykkes i et dynamisk mønster under udviklingen afParacentrotus lividus (Poustka etal., 2007), en art, der er nært beslægtet med Strongylocentrotuspurpuratus, der er anvendt i denne undersøgelse. De vigtigste træk er, at Six3-transkriptet udtrykkes i den animalske halvkugle under den sene klækning (Fig. 3A), i APD’en i det klækkede blastulastadium (Fig. 3B) og derefter i to ringe (Fig. 3G,H), den ene nær APD’ens periferi (Fig. 3C-F,H) og den anden i endomesodermen (Fig. 3C-G), under mesenkymblastulastadiet. Under gastrulation udtrykkes Six3 i nogle sekundære mesenchymceller spredt ud over hele blastocoelen og ved spidsen af archenteronet (Fig. 3I, pil), som rapporteret af Howard-Ashby et al. (Howard-Ashby etal., 2006b), i celler i dyrepolen (Fig. 3I, J) og i oral ektoderm (Fig. 3J, K). På pluteusstadiet påvises Six3 RNA i to klynger af celler, der flankerer munden (Fig. 3K, pile) og i det cilierede bånd (Fig. 3K).
Six mRNA samlede niveauer på det tidlige mesenchym blastula stadie ændres ikke signifikant ved Δcadherin mRNA-injektion (Tabel 1). In situhybridiseringer er i overensstemmelse med dette resultat og viser, at fordelingen varierer i Δcadherin mRNA-injicerede embryoner, idet den er fraværende i vegetalceller og bevarer det brede udtryk i dyrehemisfæren, som er etableret før restriktion af processer, der er afhængige af kanonisk Wnt (se Fig. S2 i det supplerende materiale).
Six3-funktion er nødvendig for APD-dannelse ogdifferentiering af neuroner
For at teste funktionen af Six3 injicerede vi to forskellige Six3-translationsblokerende morfolinoer i befrugtede æg, som hver især fremkaldte de samme udviklingsdefekter. Embryoner på 3 dage antog en afrundet morfologi (Fig. 4A,B), og spicules var enten reduceret eller fraværende. Dyrepolens ektoderm manglede den fortykkede epithelmorfologi, der er karakteristisk for dyrepladen (Fig. 4, sammenlign A,B med C,parentes). I nogle embryopakker foregik gastrulation normalt, selv om den var forsinket, og positionen af archenteronet viste, at oral/aboralpolaritet var etableret (Fig.4A). I andre partier exogastrulerede de fleste embryoner. I embryoner, der manglede Six3, var den neurale differentiering stærkt hæmmet, hvilket blev påvist ved immunfarvning for neurale markører, der normalt udtrykkes i lategastrula- og pluteusstadierne (Fig.4, sammenlign A,B med C). Flertallet (2/3) af embryonerne indeholdt noserotonergiske neuroner, og de resterende havde et reduceret antal (Fig. 4D) sammenlignet med det normale antal på dette stadium (3-5). Det samme var tilfældet for alle andre neuroner,analyseret ved hjælp af den pan-neurale markør synaptotagmin (1e11)(Fig. 4A,B)(Fig. 4A,B), som findes i APD og det ciliede bånd i normale 3-dages embryoner(Fig. 4C). Det er bemærkelsesværdigt, at ekspressionen af hbn blev reduceret til et niveau, der ikke kunne påvises ved in situhybridisering (Fig. 4F versus Fig. 4E). QPCR-målingerbekræftede denne observation og viste, at niveauerne af både hbn ogfoxq2 mRNA’er, som markerer henholdsvis de ydre grænser og de indre dele af APD’en, var reduceret 8- til 10-foldigt i Six3-morfanter på themesenchym-blastula-stadiet (Fig.5).
Temporale ekspressionsprofiler af gener i det foreløbige tidlige APD-sæt. Profileringsmetoderne var som beskrevet af Wei et al.(Wei et al., 2006). Værdier ved forskellige timer efter befrugtning fra 2 til 72 er vist som en procentdel af den maksimale signalintensitet for hvert gen ved 2-celle (maternel RNA), 15-timers tidlig blastula (EB), 30-timers sen mesenchym-blastula (LMB), 48-timers lategastrula (LG) og 72-timers pluteus-larve (PL). Profilerne er grupperet efter tidspunktet for den tidligst påviselige ekspression: (A) maternel; (B,C) tidlig blastula; (D) tidlig blastula til mesenchymeblastula. Placeringen af den stiplede linje repræsenterer tidspunktet for analysen i Six3morphanter. Data for Six3-genet er fremhævet med en rød pil.
Six3 er påkrævet for ekspression af de fleste gener i E-APD-sættet
Den slående fænotype, der fremkommer ved tab af Six3, samt dets tidlige ekspression i embryonet, antydede, at det kunne fungere nær toppen af detAPD-genregulerende netværk. For at undersøge denne mulighed yderligere brugte vi mikroarray-analyse til at søge efter Six3-afhængige gener ved 27 timer, det tidspunkt, hvor generne i E-APD-sættet nærmer sig maksimale ekspressionsniveauer. For at eliminere Six3’s endomesodermale funktioner udførte vi denne screening iΔcadherin-injicerede embryoner. Som vist i figur 5A eliminerede tab af Six3 i disse embryoner fuldstændigt udviklingen af alle de overskydende neuroner, der blev fundet i Δcadherin-injicerede embryoner, og der blev ikke dannet noget fortykket epithel, hvilket igen viser en vigtig rolle for Six3 i APD-udviklingen. Mikroarraydataene identificerede et overraskende stort antal genprædiktioner (682), som blev kraftigt nedreguleret (mindst 4 gange) i embryoner dobbeltinjiceret med Δcadherin mRNA og Six3-MO sammenlignet med embryoner injiceret med Δcadherin mRNA alene. Desuden blev mere end 60 % af alle gener i den tidligere mikroarray-screening, som blev opreguleret mindst 3 gange iΔcadherin mRNA-injicerede embryoner, og som derfor sandsynligvis blev udtrykt i APD’en, signifikant nedreguleret ved tab af Six3. Det er vigtigt, at mikroarray-data indikerede, at størstedelen af E-APD-generne var følsomme over for Six3 (Fig. 5B, gul). I god overensstemmelse hermed viste QPCR-målinger i to andre partier af embryoer, at kun 5 E-APD-gener ikke var signifikant afhængige af Six3 (Fig. 5B, rød, blå).
Six3 overekspression er tilstrækkelig til at udvide APD
Disse resultater støtter kraftigt ideen om, at Six3 fungerer tidligt i APD-genreguleringsnetværk, og rejser muligheden for, at det kan være tilstrækkeligt til at inducere andre celler i embryoet til at vedtage APD-skæbner.Missekspression af Six3 resulterede i embryoner, der viste en ekstraordinær ændring i morfologien. Et hesteskoformet bånd af tætpakkede celler strakte sig i vegetal retning fra dyrepolen (Fig. 6, sammenlign B,C med A).Serotonergiske neuroner, som normalt er begrænset til dyrepladen (Fig. 6D), blev firedobbelt så mange som muligt og var fordelt langs det tætte bånd (Fig. 6G). Desuden ligner kolonneformerne og arrangementet af neurale projektioner i celler, der indeholderynaptotagmin (1e11), dem i dyrepladen hos kontrolembryoner (Fig. 6E, hvid stiplet boks i forhold til Fig.6H). Alle disse celler indeholder i deres kerner NK2.1 (Fig. 6J-M, grøn), en transkriptionsfaktor, der normalt udtrykkes i dyrepladen og den tilstødendeupra-orale ektoderm (Fig. 6I, I′; grønne cirkler i Fig. 6U), samt nogle få celler i forboderne (Takacs et al., 2004). En kæde af 1e11-positive neurale celler deler båndet i to dele (Fig. 6K, rød), og celler på den inderste side af det NK2.1-positive bånd udtrykker også Gsc (Fig. 6L,N, rød). Kombinationen af NK2.1 og Gsc markerer entydigt det supra-orale ansigtsepithel ved den orale kant af dyrepladen (fig. 6I,I′, gule celler og fig. 6U, gule cirkler). De tætpakkede søjleformede celler i det udvidede bånd omgiver mere fladtrykte epithelceller, der udtrykker NK2.1, men ikke Gsc (fig. 6M,N), ligesom cellerne i de øverste regioner af munden hos normale embryoner (fig. 6I, mund, m). Et yderligere bevis for, at disse celler ligner dem nær munden i normale embryoner, er, at de udtrykker hbn mRNA, som i normale 3-dagesembryoner akkumuleres omkring kanten af dyrepladen og strækker sig ind i den supra-orale ektoderm (Fig.1, Fig. 6O). ISix3-misexpressende embryoner er hbn-positive celler koncentreret i det tynde epithel ved den vegetale pol og er således placeret i samme position i forhold til den udvidede dyreplade og de Nk2.1-positive celler i den øvre forgård som i normale embryoner (Fig.6P,Q). Den side, der ligger over for den orale region, differentierer sig som et tyndt, skummet epithel, udtrykker den aborale ektodermmarkør Spec1 (Fig. 6R-T) og kan svare til den hbn-positive strimmel af aboral ektoderm, der støder op til dyrepladen. Tilsammen fører disse genekspressionsmønstre til den bemærkelsesværdige konklusion, at Six3 er tilstrækkelig til at omspecificere skæbnen for cellerne i det meste af resten af embryonet og generere et 3-dages embryon bestående af et stærkt udvidet, men korrekt mønstret, dyrepoldomæne med oral/aboralpolaritet. APD i normale og Six3-misexpressende embryoner er markeret med deblå cirkler i fig. 6U.
Helmonteret in situ-hybridisering for six3 mRNA underudviklingen. Tidspunkter som timer efter befrugtning er vist i det øverste højre hjørne af hvert billede. (A) Meget tidlig blastula. (B) Klækkende blastula. (C-H) Mesenchymblastula. (I,J) Lategastrula. (K) Pluteus. Alle embryoner er vist i sidebillede, undtagen i G og H, som illustrerer henholdsvis plantepolen (vv) og dyrepolen (apv). Pilene i I og K markerer positionerne af henholdsvis sekundære mesenchymceller og celler, der flankerer munden. Skala bar: 20 μm.
Tab af Six3 resulterer i tab af neuroner og det fortykkede epithel, der er karakteristisk for APD. (A,B) Tre-dages embryoner injiceret med Six3-MO2 i en-celle-stadiet, som er typiske for henholdsvis stærkere og svagere fænotyper. (C) Normalt 3-dages embryo. APD i A-C angivet i parentes; 1e11 (pan-neural, magenta), serotonin (grøn), DAPI (kerner, blå). (D) Antal embryoner, der indeholder enten 0, 1, 2 eller 3 serotonergiske neuroner pr. embryo i Six3-morfanter. På dette stadium har normale embryoner fra 3 til 5 serotonerge neuroner. (E,F)hbn mRNA i normale mesenchymblastulae (E) eller i Six3-morphanter (F).Skala: 20 μm.
Da miseksprimeret Six3 kan udvide hele APD og fremme udviklingen af ektopiske neuroner, spurgte vi, hvilke gener i E-APD-gen-sættet der blev opreguleret, ved hjælp af mikroarray- og QPCR-målinger.Tabel 2 viser 10 sådanne gener, hvis mRNA-niveauer er forhøjet mindst 3 gange i Six3 mRNA-injicerede embryoner.
- Se inline
- Se popup
Gener opreguleret i Six3-misexpressende embryoner
Six3 kan undertrykke TGF-β-signalering, men eliminerer ikke oral/aboral polaritet
Six3-missexpression eliminerer ikke oral/aboral polaritet, fordi orale ogaborale ektodermmarkører udtrykkes på modsatte sider af embryonet, og neuroner, der normalt findes i APD, er begrænset til et mellemliggende bånd.Imidlertid reducerer miseksprimeret Six3 ekspressionen af nodal såvel som af lefty og chordin i mesenchym-blastulae (Tabel 3, venstre), måske fordi Six3 giver positivt input til ekspression af FoxQ2, som har vist sig at undertrykke ekspression af nodal (Yaguchi et al.., 2008).Overraskende nok undertrykker Six3 ikke bmp2/4 mRNA-akkumulering lige så meget som det reducerer nodal, selv om bmp2/4-ekspression kræver nodal funktion i normale embryoner (Duboc et al., 2004). Dette tilsyneladende paradoks kan skyldes en kombination af reduceret Chordin-medieret hæmning af BMP2/4-signalering kombineret med diffusion af BMP2/4 og efterfølgendeautoaktivering, som det er blevet påvist i andre systemer (Biehs et al, 1996;Jones et al., 1992).
- Vis inline
- Vis popup
Six3-regulering af signalvejskomponenter
Følsomheden af tidlige APD-regulerende gener over for tab af Six3. A) Tre-dages embryoner injiceret med Δcadherin mRNA (øverst) eller medΔcadherin mRNA og Six3-MO (nederst). Pilen angiver orienteringen af den dyr-vegetale akse. Embryoerne er immunfarvet med anti-serotonin og1e11, en pan-neural markør. (B) QPCR-cyklusændringer (blå og røde søjler)eller log2-signalintensitetsforskelle (gule søjler) (y-akse, venstre) eller foldændringer (y-akse, højre) i niveauerne af individuelle mRNA’er i to partier (røde og blå søjler) af Six3-morfant- og kontrolembryoer efter 27 timer, der begge indeholder Δcadherin. Gener, hvis ekspression er ændret mindst 3 gange, er til venstre for den grønne linje.
Kanoniske Wnt-, ikke TGF-β-signaler forhindrer APD-udvidelse ind i den laterale ektoderm
De signaler, der afgrænser APD’en, afhænger af den kanoniske Wnt-signalering, da dens eliminering gør det muligt for APD’en at omfatte næsten hele embryoet (Yaguchi et al., 2006)(Fig. 1). Da Nodal og BMP er afhængige af kanoniske Wnt-signaler, eliminerede vi begge TGF-β-ligander med enNodal-MO (Yaguchi et al.,2008) for at teste, om de var ansvarlige for den Wnt-afhængige begrænsning af APD’en. Fig.7B,F viser, at dette ikke er tilfældet, fordi serotonergiske neuroner forbliver begrænset til APD i disse embryoner. Men når Nodal-morphanterne forsynes med eksogen Six3, øges antallet af serotonerge neuroner kraftigt og optræder i hele den animalske halvdel af embryoet (Fig. 7D), som det er observeret iΔcadherin-misexpressende embryoner (Yaguchi et al., 2006), hvilket svækker den kanoniske Wnt-signalering. Derfor kan ektopisk ekspression af Six3 tilsidesætte de andre signaler, formodentlig Wnt, der begrænser disse neuroner tilAPD i normale embryoner.
Selv om serotonerge neuroner ikke dannes i den laterale ektoderm i Nodalmorphants, gør nogle ikke-serotonerge neuroner det(Fig. 7B). Dette skyldes primært, om ikke udelukkende, tab af BMP2/4-signalering, da det samme resultat opnås i BMP2/4-MO-injicerede embryoner (S.Y., J.Y., L.M.A., R.C.Aand R.D. Burke, upubliceret). Da udviklingen af alle neuroner afhænger afSix3 i det normale embryo, spurgte vi, om de ektopiske neuroner i Nodalmorphants også afhænger af Six3 ved samtidig at injicere Nodal-MO og Six3-MO. Som forventet gik de serotonerge neuroner, der var til stede ved dyrepolen i Nodalmorphanter, tabt i dobbeltmorphanterne (Fig. 7G,H). Disse embryoner indeholder ikke differentierede ikke-serotonergiske neuroner med axonale processer, selv om der blev observeret nogle 1e11-immunoreaktive pletter. Disse kunne indikere tilstedeværelsen af ufuldstændigt differentierede neuroner eller afspejle en oprindelig neural bias af ektodermceller, som normalt tilsidesættes af TGF-β-signalering.
Six3 kan modvirke Wnt-signalering
Den kendsgerning, at APD ikke udvides i Nodal-morphanter, men gør det iΔcadherin-injicerede embryoner, og at Six3 kan overvinde kanoniske Wnt-afhængige virkninger i den laterale ektoderm, rejser den mulighed, at Six3 undertrykker Wnt-signalering. Til støtte for denne hypotese finder vi, at Six3misexpression nedregulerer de fleste af de gener, der koder for Wnt-ligander, som udtrykkes under den tidlige udvikling (Tabel3, venstre) (Fig. 8).Et af disse er Wnt8, et afgørende vegetabilske signal, der er nødvendigt for normal udvikling af endomesoderm (Wikramanayake etal., 2004), et resultat, der er i overensstemmelse med den manglende vegetabilske udvikling i Six3-misexpressende embryoer. Samlet set tyder disse resultater på, at grænserne for APD bestemmes af Six3/Wnt antagonisme.
Six3 er ikke tilstrækkelig til at undertrykke ekspression af wnt ognodal i APD
Six3’s evne til kraftigt at nedregulere (direkte eller indirekte) gener, der koder for Wnt-ligander, samt nodal, lefty og chordin, rejser muligheden for, at det normalt forhindrer ekspression af disse gener i APD. For at vurdere dette undersøgte vi først virkningerne af Six3 på genekspressionen i Δcadherin-injicerede embryoner for at eliminere mulige modvirkende virkninger af Six3-funktionen i endomesodermen. Både mikroarray- og QPCR-data viser, at i embryoner, der hovedsagelig består af APD, undertrykker Six3 ekspressionen af Wnt-generne og nodal-, lefty- og chordin-generne (tabel 3; fig. 8). I normale embryoner (glycerol-injiceret) kan Six3-repression af disse gener imidlertid ikke påvises (Tabel 3;Fig. 8), hvilket indikerer, at yderligere mekanismer beskytter APD mod Wnt- og TGF-β-ekspression i det normale embryo.
Six3-regulering af andre signalveje
Six3 regulerer også positivt (enten direkte eller indirekte) gener, der koder for proteiner, der fungerer i andre signalveje (Tabel 3). Disse omfattedeelta, Notch-liganden, der formidler lateral hæmning, en afgørende proces i neural udvikling, samt andre potentielle regulatorer af neurogensis. Sidstnævnte omfatter fgf9/16/20, fgfr-lignende, en membranbunden receptor uden tyrosinkinase-domæne, og frizzled5/8, en Wnt-receptor, der kan formidle ikke-kanoniske signaler, men hvis funktion i APD er ukendt (Croce etal., 2006). Fremtidige undersøgelser vil undersøge, hvordan aktiviteterne i disse signalveje og tidlige Six3-afhængige transkriptionsfaktorer interagerer i det APD-genregulerende netværk.
Misexpression af Six3 omdanner embryoet til en udvidet APD. Allembryoerne er 3 dage gamle. (A) Normalt embryo, DIC; blastopore view, oralup. (B,C) Six3 mRNA-misexpressende embryoner, DIC; (B)oral visning, (C) lateral visning; pilene i B angiver grænsen mellem den udvidede dyreplade og det mere vegetale tynde epitel.(D,E) Serotonergiske (sero, grøn) og alle (1e11, magenta) neuroner i normale embryoner. (F-H) DIC- og immunostoffer, som i D og E af seks3 mRNA-misexpressende embryoner; oral visning, dyrepolen opad. (I,I′) Immunostoffer af normale 3-dages embryoner for NK2.1 (grøn) og Gsc (magenta); (I) lateral visning; celler i APD til højre for den hvide stiplede linje; (I′) oral visning, celler i APD er mellem de stiplede hvide linjer. NK2.1-positive celler markeret med pilespidser er i blastocoelen og er ikke en del af APD; m, mund; m, mund (J-T)six3-mRNA-misexpressende embryoner. (J,K) NK2.1 (grøn); 1e11 (magenta). (L-N) NK2.1 (grøn); Gsc (magenta). (O-Q) DIC-billeder af hbnwhole-mount in situ-hybridiseringer på kontrol- (O) og six3mRNA-injicerede embryoner (P,Q); dyrestolpe opad; hvid cirkel i O markerer demouth. (R-T) En gennem-fokal serie af et embryo farvet med DAPI og for1e11 (grøn) og Spec1 (magenta) epitoper; Spec1 mærker den tynde, ekspanderedeaborale epidermis, som falder sammen og rynker sig under forberedelsen. (U)Diagram, der illustrerer fordelingen af APDcelletyper i normale ogSix3-mRNA-misexpressende embryoner. De farvede prikker viser fordelingen af celler, der udtrykker de angivne proteiner eller mRNA’er, og sorte og lilla ovaler angiver henholdsvis serotonergiske (Sn) og ikke-serotonergiske neuroner (n-Sn).Grønne og blå skraveringer identificerer henholdsvis ansigtsepitel og cilieret bånd. Six3 mRNA-injektion (pil) resulterer i et sfærisk 3-dages embryon (til højre; se også B, C), der stort set består af det område, der er skitseret med blå farve i det normale embryon (til venstre). I det Six3-mis-eksprimerende embryo udvides antallet af neuroner og NK2.1/gsc-positive (gule; supraoral) celler kraftigt, og dehbn-positive celler (blå), som normalt flankerer dyrepladen på oralsiden på dette stadium, findes ved den vegetale pol. Pilene angiver placeringen af de orale-aborale og dyrisk-vegetale akser i både normale ogSix3-misexpressende embryoner. Skalaer: 20 μm.