Abstract
Objektiv. Serum pepsinogen-testen har begrænsning i sin prædiktive effekt som en ikke-invasiv biomarkør til screening for mavekræft. Vi havde til formål at undersøge, om kombinationen af TFF3 og pepsinogen kunne være en effektiv biomarkør til påvisning af mavekræft selv i de tidlige stadier. Metoder. I alt 281 patienter med tidlig mavekræft (EGC), som gennemgik en endoskopisk submucosal dissektion i Korea, og 708 raske personer fra Japan blev indskrevet i afledningskohorten. Valideringskohorten omfattede 30 koreanske patienter med EGC og 30 koreanske raske kontrolbloddonorer. TFF3-niveauerne i serum blev undersøgt ved hjælp af enzyme-linked immunosorbent assay. Resultater. Ved anvendelse af en grænseværdi på 6,73 ng/mL i afledningskohorten var følsomheden af kombinationen af test til EGC-detektion overlegen (87,5 %) i forhold til TFF3 (80,4 %) eller pepsinogen-testen alene (39,5 %). På samme måde var følsomheden af TFF3 plus pepsinogen i valideringskohorten højere (90,4 %) end følsomheden af TFF3 (80,0 %) eller pepsinogentesten alene (33,3 %). Konklusion. Kombinationen af serum TFF3 og pepsinogen er en mere effektiv ikke-invasiv biomarkør til påvisning af mavekræft sammenlignet med pepsinogen eller TFF3 alene, selv i EGC. Dette forsøg er registreret med NCT03046745.
1. Introduktion
Mastrisk kræft er den tredje vigtigste årsag til kræftdød i verden . Ca. halvdelen af mavekræfttilfælde diagnosticeres i fremskredne stadier. En af årsagerne hertil er den invasive karakter af esophagogastroduodenoskopi (EGD) screeningsundersøgelser, der fører til, at patienterne undgår nødvendige undersøgelser . Begrænsningen af pepsinogentesten som en ikke-invasiv serologisk biomarkør-screeningsmetode er, at den optimale grænseværdi kan påvirkes af flere faktorer, såsom H. pylori-infektion, alder, køn og selve testmetoden .
Trefoil factor-familien (TFF) af peptider omfatter små (12-22 kDa) molekyler, som udskilles af pattedyrs mave-tarmkanalen. De er ekstremt stabile under sure forhold og modstandsdygtige over for nedbrydning ved varme og proteolytisk fordøjelse. TFF’er udgør en familie af tre peptider (TFF1, TFF2 og TFF3), der udtrykkes i vid udstrækning på en vævsspecifik måde i mave-tarmkanalen. TFF3 udtrykkes i gobletcellerne i tynd- og tyktarmen samt i intestinal metaplasi i maven . Serum TFF3 blev vist at være et bedre potentielt screeningsværktøj for mavekræft end pepsinogen i Japan .
Disse egenskaber ved TFF3 fik os til at analysere, om serum TFF3 kan være en biomarkør for tidlig mavekræft (EGC) i koreanere såvel som i den japanske befolkning. Der er ingen tidligere undersøgelse af serum TFF3 som en biomarkør i EGC-populationen uden avanceret gastrisk cancer (AGC). Da påvisning af kræft i et tidligt stadie er forbundet med forbedret overlevelse, er vores hypotese, at kombinationen af TFF3 med pepsinogen kan øge følsomheden ved påvisning af EGC. Vi undersøgte således, om kombinationen af serum TFF3- og pepsinogentest kunne være et mere effektivt ikke-invasivt værktøj til påvisning af EGC.
2. Materialer og metoder
2.1. Forsøgspersoner
2.1.1.1. Undersøgelsespopulation af afledningskohorte
Patientgruppen bestod af 281 EGC-patienter, som gennemgik en endoskopisk submucosal dissektion på Kyungpook National University Medical Center i Korea fra januar 2011 til maj 2013. Vi udtog blodprøver fra alle patienterne før deres endoskopiske behandling. Kontrolgruppen bestod af 708 raske mandlige og kvindelige bloddonorer, som havde fået et helbredstjek på Yamanaka-klinikken i Japan fra oktober 2011 til december 2012. Biopsiprøverne til denne undersøgelse blev stillet til rådighed af National Biobank of Korea, Kyungpook National University Hospital (KNUH), som støttes af Ministeriet for Sundhed, Velfærd og Anliggender. Alle materialer, der stammer fra National Biobank of Korea, KNUH, blev indhentet i henhold til protokoller, der er godkendt af det institutionelle review board.
2.1.2. TFF3-værdi i valideringskohorten
I afledningskohorten i den aktuelle undersøgelse bestod kontrolgruppen af japanske personer, og vi har ikke opnået resultaterne af serumpepsinogen i kontrolgruppen. For at teste vores resultater i en anden valideringskohorte med både patienter og kontroller fra samme land var det nødvendigt med den koreanske valideringskohorte. Valideringskohorten var en uafhængig kohorte, der indeholdt 30 koreanske EGC-patienter fra august 2016 til december 2016 og 30 koreanske raske kontrolbloddonorer, der modtog et helbredstjek, herunder EGD, fra august 2016 til december 2016. Deres data blev prospektivt indsamlet og analyseret for at validere TFF3-værdien. De undersøgelsesprotokoller, der blev anvendt til forsøgspersoner i valideringskohorten, var identiske med dem, der blev anvendt til forsøgspersoner i afledningskohorten. Validiteten af kombinationen af TFF3 og pepsinogen til påvisning af EGC hos koreanske personer blev vurderet ved hjælp af ROC-analyse (receiver operating characteristic).
2.2. Metoder
2.2.2.1. Konstruktion af humane TFF3-ekspressionsplasmider
Human TFF3 komplementær deoxyribonukleinsyre (cDNA) blev klonet fra Human Small Intestine Marathon-Ready cDNA (Clontech, Mountain View, CA, USA) ved hjælp af polymerasekædereaktion. Til ekspression af His-mærkede Escherichia coli-fragmenter af det humane TFF3-cDNA blev indsat i vektoren pET-21a(+) (Novagen) for at skabe pET-hTFF3-His .
2.2.2. Ekspression og oprensning af rekombinant humant TFF3
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL-bakterier (Stratagene, Santa Clara, CA, USA) blev transformeret med pET-hTFF3-His-plasmidet og derefter dyrket i lysogeny bouillonmedium ved 37 °C. Ekspression af rekombinant protein blev induceret ved at inkubere cellerne med 1 mmol/L isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid i 5 timer. Bakteriepellets blev høstet, de opløselige proteinfraktioner blev ekstraheret ved sonicering i 0,2 % Triton X-100 og 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0), og rekombinante humane TFF’er blev oprenset ved Ni-Resin-kromatografi (Invitrogen, Tokyo, Japan). Rekombinante humane TFF’er blev elueret fra Ni-Resin-kolonnen med 0,5 mol/L imidazol, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0) og 0,5 mol/L NaCl. Hver elueringsfraktion blev analyseret ved at udføre natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese og Western Blot-analyse. Koncentrationerne af de oprensede rekombinante humane TFF’er blev målt ved hjælp af et proteinassay (Bio-Rad Laboratories Inc., Tokyo, Japan) .
2.2.2.3. Immunoassays for TFF3, Pepsinogen I, Pepsinogen II og Helicobacter pylori-infektionsstatus
Serum TFF3-niveauer blev målt ved at udføre enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Antisera blev fremstillet fra kaniner, der var immuniseret med humane TFF’er. Følsomheden af TFF3 var 30 pg/mL. Serum pepsinogen I- og pepsinogen II-niveauerne blev målt ved hjælp af latexforstærket turbidimetrisk immunoassay (Hitachi Ltd, Tokyo, Japan), og pepsinogen I/pepsinogen II-forholdet blev beregnet.
En positiv H. pylori-infektionsstatus var afhængig af mindst en af følgende test, der viste tegn på infektion: histologi, hurtig urease-test og -urea åndedrætstest.
2.3. Statistisk analyse
Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af JMP7-software (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) eller SPSS version 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Gennemsnittet af variabler blev sammenlignet mellem to grupper ved hjælp af en t-test. ROC-kurven for hver evaluering blev brugt til at udtrække det tilsvarende cutoffpunkt, som kan bruges til at skelne mellem forskellige mavestatuser. Til dette formål blev arealet under hver ROC-kurve anvendt til at måle modellens diskriminerende evne. Den resulterende værdi af cutoffpunktet for hver evaluering blev anvendt til bestemmelse af sensitivitet, specificitet og odds ratio. Som følge heraf blev der beregnet 95 % konfidensintervaller. En 2-sidet værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
3. Resultater
3.1. Karakteristika for aflednings- og valideringskohorterne
I afledningskohorten var der 217 (75,8 %) mandlige patienter i EGC-gruppen, og i kontrolgruppen var der 272 (38,4 %). Gennemsnitsalderen for patienterne i kræftgruppen var 63,4 ± 9,3 år, og kontrolgruppens gennemsnitsalder var 67,4 ± 11,9 år. Procentdelen af positiv H. pylori-infektion i kræftgruppen var 48,4 %. Af de 281 undersøgte tumorer blev 256 (91,1 %) histologisk klassificeret som differentieret type og 25 (8,9 %) som udifferentieret type (tabel 1). Det gennemsnitlige TFF3-niveau i serum hos patienterne med mavekræft var 9,37 ± 4,67 ng/mL, hvilket var signifikant højere sammenlignet med niveauet i kontrolgruppen (7,05 ± 3,28 ng/mL; ; Tabel 1, Figur 1).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Data er præsenteret som gennemsnit ± SD. TFF3: trefoil factor family 3; WD: veldifferentieret adenokarcinom; MD: moderat differentieret adenokarcinom; PD: dårligt differentieret adenokarcinom; SRC: signetringcellekarcinom; NA: ikke relevant.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Til valideringskohorten blev der indskrevet 30 koreanske EGC-patienter og 30 koreanske raske kontrolpersoner (tabel 1). Der var 21 (70,0 %) mandlige patienter i EGC-gruppen og 15 (50,0 %) i kontrolgruppen. Gennemsnitsalderen for EGC-patienterne var 59,5 ± 10,7 år, og for kontrolpersonerne var den 66,6 ± 12,0 år. Det gennemsnitlige TFF3-niveau i serum hos patienter med mavekræft var 9,01 ± 4,21 ng/mL, hvilket var signifikant højere end i kontrolgruppen (6,92 ± 2,76 ng/mL; ).
3,2. Effekt af H. pylori-infektion på serum TFF3-niveauer i afledningskohorten
For at teste den diagnostiske nøjagtighed af serum TFF3 til identifikation af H. pylori-infektion blandt patienter med kræft, blev der udført ROC-analyse (data ikke vist). Arealet under ROC-kurven for TFF3 var 0,445.
For at teste den diagnostiske nøjagtighed af serum-TFF3 til identifikation af EGC blev der udført en ROC-analyse. For både H. pylori-positive og Helicobacter pylori-negative patienter var sensitiviteten, specificiteten, odds ratio, arealet under kurven og cutoff-værdien for TFF3 henholdsvis 0,804, 0,576, 5,60, 0,729 og 6,73. De positive og negative prædiktive værdier for TFF3 var henholdsvis 0,430 og 0,881 (figur 2(a)). For yderligere at evaluere TFF3 blev patienterne opdelt efter H. pylori-infektionsstatus, hvorefter der blev udført ROC-analyse. Arealet under kurven var 0,716 for H. pylori-positive patienter (figur 2(b)) og 0,740 for H. pylori-negative patienter (figur 2(c)).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.3. Histologiske typer og TFF3-niveauer i serum i afledningskohorten
For at teste EGC’s indflydelse på TFF3-niveauerne i serum blev TFF3-niveauet i hver patients serum sammenlignet med deres histologiske typer af EGC. Differentieret mavekræft omfattede tilfælde med veldifferentierede eller moderat differentierede adenokarcinomer. Gastrisk cancer med histologi af udifferentieret type omfattede tilfælde med dårligt differentieret adenocarcinom eller signetringcellekarcinom. Serum TFF3-niveauerne hos patienter med differentieret type og hos patienter med udifferentieret type EGC var ikke signifikant forskellige (henholdsvis 9,53 ± 4,83 ng/mL mod 7,66 ± 1,82 ng/mL; ). På den anden side var serum TFF3-niveauet hos patienter med EGC af tarmtypen signifikant højere end hos patienter med den diffuse type (henholdsvis 9,54 ± 4,78 ng/mL mod 7,16 ± 1,89 ng/mL; ; Figur 3). I enhver anden patologisk status af EGC, såsom submucosal invasion eller lymfekar-invasion, var der ingen signifikant forskel i serum TFF3-niveauerne (data ikke vist).
(a)
(b)
(a)
(b)
(a)
(b)
3.4. Kombination af serum TFF3- og pepsinogentest i afledningskohorten
Vi analyserede nytten af at bestemme TFF3-niveauet sammen med pepsinogentest. Antallet af patienter med mavekræft og positive eller negative resultater for begge test i den foreliggende undersøgelse er vist i tabel 2. Cutoff-værdierne til at definere en positiv pepsinogentest var et serumpepsinogen I-niveau på <70 ng/mL og et serumpepsinogen I/II-forhold på <3. Under disse cutoff-værdier blev det vist, at 170 af de 281 patienter med EGC ikke havde kræft ved pepsinogenscreening alene. Men da serum-TFF3-test blev tilføjet til mavekræftscreeningen, kunne 135 af de 170 EGC-patienter, som ikke blev identificeret ved pepsinogenundersøgelse, identificeres ved TFF3-undersøgelsen. På den anden side blev 20 af de 281 patienter ikke opdaget ved TFF3-undersøgelse, men blev opdaget ved pepsinogenundersøgelse.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
TFF3: Trefoil factor family 3. Serum pepsinogen test (+): pepsinogen I < 70 ng/mL og pepsinogen I/II ratio < 3.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sensitiviteten af de enkelte pepsinogen- og TFF3-tests var henholdsvis 39,5 % og 80,4 %. Med kombinationstest var følsomheden for tilstedeværelse af mavekræft 87,5 %, hvilket var højere end ved TFF3-testning alene.
3.5. Kombination af serum TFF3- og pepsinogentest i den koreanske valideringskohorte
For at teste den diagnostiske ydeevne af pepsinogentest og serum TFF3 til identifikation af EGC i den koreanske valideringskohorte blev der udført en ROC-analyse (Figur 4). Sensitiviteten, specificiteten, odds ratio og arealet under kurven for pepsinogentest til påvisning af EGC i henhold til definitionen af pepsinogentest var henholdsvis 0,333, 0,933, 7,00 og 0,633. Ved anvendelse af cutoff-værdien på 6,73 ng/mL for TFF3 var disse værdier for TFF3 henholdsvis 0,800, 0,433, 3,06 og 0,651. For kombinationen af TFF3 og pepsinogen l/ll-forholdet var de henholdsvis 0,900, 0,367, 5,21 og 0,756.
De positive og negative prædiktive værdier for pepsinogen l/ll-forholdet var henholdsvis 0,833 og 0,583, og for TFF3 var de henholdsvis 0,585 og 0,684. De for kombinationen af TFF3 og pepsinogen l/ll-forholdet var henholdsvis 0,587 og 0,786.
4. Diskussion
Pepsinogentesten anvendes til screening for mavekræft i Japan , hvor testens sensitivitet i befolkningsbaserede undersøgelser varierer fra 71 % til 84 %, og specificiteten varierer fra 57 % til 78 % . I den foreliggende undersøgelse sammenlignede vi serum TFF3 med serum pepsinogen test som serologiske screeningsværktøjer til påvisning af EGC hos koreanske patienter. Sensitiviteten af pepsinogentesten var 39,5 % i den afledte kohorte, hvilket viser en lavere sensitivitet end dem i de japanske undersøgelser. Det ser ud til, at pepsinogentesten for mavekræft let påvirkes af forskellige faktorer, herunder H. pyloristatus og selve testmetoden, og at den derfor ikke opfylder de ideelle screeningskriterier . På den anden side viste serum TFF3-testen en højere følsomhed (80,4 %) end pepsinogentesten til påvisning af EGC i vores undersøgelse. Desuden blev resultaterne af serum-TFF3-testen ikke påvirket af H. pyloristatus. Tilsvarende viste en nyere japansk undersøgelse af 1260 raske personer, at serum TFF3-værdierne ikke var væsentligt påvirket af H. pyloristatus og -udryddelse . Forfatterne foreslog, at serum TFF3 kunne være en stabil biomarkør for mavekræft selv efter H. pylori-udryddelse i modsætning til pepsinogen-testen . Da TFF3 ikke udtrykkes i epitelceller i maven og kun udtrykkes i tarmens gobletceller i metaplasien, er serum TFF3-niveauerne mindre påvirket af H. pylori-infektion .
TFF’erne, der består af TFF1, TFF2 og TFF3, udtrykkes i høj grad i væv, der indeholder slimproducerende celler . De spiller en nøglerolle i opretholdelsen af slimhindeintegritet og onkogen transformation, vækst og metastatisk udvidelse af solide tumorer . TFF3 udtrykkes i gobletceller i tynd- og tyktarmen samt i intestinal metaplasi i maven .
Nylige data tyder på, at TFF’er i serum, især TFF3, kunne være potentielle biomarkører til påvisning af mavekræft. I en japansk undersøgelse udført på 183 patienter med mavekræft og 280 raske personer, hvor der blev anvendt en grænseværdi på 3,6 ng/mL for TFF3, steg odds ratio for mavekræft signifikant (odds ratio 18,1; 95 % konfidensinterval 11,2-29,2), og sensitiviteten og specificiteten for forudsigelse af mavekræft var henholdsvis 80,9 og 81,0 % . Ved sammenligning af ROC-kurverne for pepsinogen I/II-forholdet, TFF3 og TFF3 plus pepsinogen I/II-forholdet viste det sig, at TFF3 plus pepsinogen havde bedre resultater med hensyn til mavescreeningsmarkør end pepsinogen- eller TFF3-testen alene . I en anden undersøgelse udført på 192 patienter med mavekræft og 1254 kontroller var sensitiviteten og specificiteten af pepsinogentest til forudsigelse af mavekræft henholdsvis 67 % og 82 %, mens en kombination af serum TFF3- og pepsinogentest viste en sensitivitet på 80 % og specificitet på 80 % i forbindelse med påvisning af mavekræft . Disse tidligere resultater er i overensstemmelse med resultaterne fra vores undersøgelse af patienter med EGC. Vi sammenlignede også kombinationen af serum-TFF3 og pepsinogen med TFF3- eller pepsinogentest alene. ROC-kurven for TFF3 til forudsigelse af tilstedeværelse af EGC viste, at sensitiviteten, specificiteten og området under kurven var henholdsvis 80,4 %, 57,6 % og 0,729 ved anvendelse af en grænseværdi på 6,73 ng/mL i afledningskohorten. Følsomheden af kombinationen af test (87,5 %) for påvisning af EGC var bedre end TFF3-testen (80,4 %) eller pepsinogentesten alene (39,5 %). På samme måde viste ROC-kurven for TFF3 i valideringskohorten, at sensitiviteten, specificiteten og arealet under kurven var henholdsvis 80,0 %, 43,3 % og 0,651 ved anvendelse af en grænseværdi på 6,73 ng/mL. Arealet under kurven for TFF3 plus pepsinogen I/II-forholdet (0,756) var højere end for TFF3 alene (0,651) eller pepsinogen I/II-forholdet alene (0,633). Desuden var følsomheden af TFF3 plus pepsinogen (90,0 %) højere end følsomheden af TFF3 (80,0 %) eller pepsinogentest alene (33,3 %). TFF3 er en mere nyttig markør end pepsinogentest til påvisning af EGC, og kombinationen af serum-TFF3 plus pepsinogen er mere effektiv end TFF3 eller pepsinogen alene.
Vi evaluerede også forholdet mellem TFF3 og EGC-histologiske typer i henhold til henholdsvis differentiering og Lauren-klassifikation. Vi fandt, at serum TFF3-niveauerne hos patienter med gastrisk cancer af differentieret type var højere end hos patienter med histologi af udifferentieret type, selv om disse forskelle ikke viste statistisk signifikans (). Serum TFF3-niveauerne hos patienter med mavekræft af tarmtypen var signifikant højere end hos patienter med diffust type kræft (). Huang et al. rapporterede lavere TFF3-koncentrationer i serum hos kinesiske patienter med mavekræft af differentieret type og af tarmtypen. Resultaterne af vores undersøgelse er således ikke i overensstemmelse med deres rapport. Derimod er vores undersøgelse i høj grad i overensstemmelse med rapporten fra Kaise et al. i Japan, som fandt, at følsomheden af TFF3-testen alene og kombinationen af TFF3- og pepsinogentest i adenocarcinom af diffustype var lavere end i kræft af tarmtypen. Da TFF3 udtrykkes stærkt af gobletceller i epitelet i mavens tarmmetaplasi (i henhold til histopatogenesen af mavekræft), ville man forvente et højt TFF3-serumniveau i mavekræft af tarmtypen og af differentieret type. Der er behov for yderligere store undersøgelser for at forklare disse kontroversielle resultater og uoverensstemmelser mellem tidligere undersøgelser.
EGD er en invasiv undersøgelse, der anvendes til tidlig påvisning af mavekræft, især hos mange asymptomatiske personer. Positive resultater af kombinationen af serum TFF3 og pepsinogen for mavekræft kunne være nyttige til at tilskynde patienter til at gennemgå EGD.
Der var flere begrænsninger i denne undersøgelse. Den ene var den relativt lille stikprøvestørrelse. Vores undersøgelse viste imidlertid lignende resultater gennem to uafhængige kohorter, og dette er den første undersøgelse om den diagnostiske anvendelighed af TFF3, som kun omfattede patienter med EGC og ikke AGC. For det andet var andelen af EGC af diffus type lille. Den tidligere koreanske undersøgelse viste imidlertid lignende resultater og rapporterede, at den diagnostiske værdi af serum-TFF3 for diffuse kræftformer var noget mindre end for mavekræft af tarmtypen, selv om andelen af EGC var 49,4 % . For det tredje var kontrolpersonerne i den afledte kohorte sunde japanske og ikke koreanske personer. For at overvinde dette og validere den nuværende undersøgelse analyserede vi en anden uafhængig koreansk kontrolkohorte, og resultaterne fra begge kohorter var ens. For det fjerde viste vores undersøgelse ikke påviseligheden af prækancerøse læsioner, herunder atrofisk gastritis, ved TFF3.
Sammenfattende har denne undersøgelse vist, at serum-TFF3 kan være en mere effektiv biomarkør for EGC hos koreanere end pepsinogen-testen. Desuden havde kombinationen af TFF3 og pepsinogentest en øget diagnostisk effekt som en screeningsmodalitet. Desuden viste resultaterne, at serum TFF3-niveauet kan være forbundet med den histologiske type og differentieringstype i EGC. Der er behov for yderligere store undersøgelser for at bekræfte den stærke prædiktive effekt af serum TFF3 og kombinationstestene med TFF3 og pepsinogen hos patienter med AGC eller EGC, samt for at klarlægge serum TFF3’s rolle som en ikke-endoskopisk biomarkør i befolkningsbaseret screening for mavekræft.
Oplysning
Hyun Seok Lee er førsteforfatter.
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen konkurrerende interesser i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.
Anerkendelser
Denne undersøgelse (oplysninger om klinisk forsøg: NCT03046745) blev støttet af et tilskud fra National R&D Program for Cancer Control, Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (1631100).