Abstract
I 1992 rapporterede vi om en ny metode til sekventering af proteiner fra carboxy-terminus (C-terminus) (Boyd et al., 1992). I de sidste 2 år har vi fortsat vores undersøgelser, herunder mekanismen for den indledende aktivering af den C-terminale carboxylgruppe og de bevidste modifikationer af aminosyrernes reaktive sidekæder med sekventeringsreagenserne. Gennem udvælgelse af de reagenser og reaktionsbetingelser, der anvendes i vores sekventeringsprotokol, er asparaginsyre, glutaminsyre, serin og threonin derivatiseret. Amidering af asparaginsyre og glutaminsyre og acetylering af serin og threonin har ført til et bedre udbytte ved sekventering af disse rester. Asparaginsyre og glutaminsyre er nu, som det fremgår af tabel 1, kategoriseret som aminosyrerester, der let kan sekventeres. Vores kriterier for at afgøre, om en rest er pålideligt kaldt, er evnen til at sekventere gennem og detektere denne rest, når den er til stede i et nanomol af en proteinprøve. I gennemsnit er det muligt at sekventere 5 cyklusser på en nanomol protein påført en polyvinylidendifluoridmembran (PVDF), hvis aminosyresekvensen indeholder de rester, der er anført i kolonnen “pålideligt kaldt” i tabel 1. Vores fokus for MPSA-konferencen i 1994 er at illustrere den nuværende anvendelighed af denne C-terminale sekventeringsmetode til sekventering af proteiner, der er immobiliseret på PVDF.