Strukturen af en membran adenylylcyklase bundet til et aktiveret stimulerende G-protein

Membranintegrale adenylylcyklasser (AC’er) er nøgleproteiner i pattedyrs signaltransduktion, der reagerer på et stort udvalg af ekstracellulære og intracellulære signaler og genererer cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP) til en række nedstrøms signalbegivenheder (1, 2). Membran-AC’erne integrerer flere signalkaskader – f.eks. ved at forbinde input fra G-protein-koblede receptorer (GPCR’er), ændringer i intracellulære Ca2+-koncentrationer (3) og lipid-signalkaskader (4). Der findes ni AC-subtyper hos pattedyr, der er klassificeret som AC1 til AC9 (5). På grundlag af aminosyresekvensen har alle AC-subtyperne den samme overordnede forudsagte arkitektur. De er polytopiske membranproteiner, der består af 12 transmembranhelixer (TM) og har cytosolske N- og C-terminaler. De første seks TM-domæner (TM1-TM6) i AC-polypeptidet efterfølges af en cytosolisk region, der omfatter et katalytisk domæne (C1a), efterfulgt af et C1b-domæne, den anden TM-region, TM7-TM12-bundtet, og derefter et andet katalytisk domæne (C2a) og et C-terminalt C2b-domæne. De N- og C-terminale dele af proteinerne er meget variable, mens de mest bevarede dele er C1a- og C2a-domænerne, som hører til klasse III-nukleotidylcyklaserne (5, 6). Røntgenkrystallografi af en chimær AC5C1/AC2C2 i et kompleks med den stimulerende G-proteinunderenhed Gαs (7, 8) afslørede de vigtigste træk ved AC-katalysatormaskineriet og bidrog til formuleringen af en detaljeret mekanisme for cAMP-produktion af de G-proteinafhængige AC’er (7, 8). Hver af pattedyrmembran-AC’erne omfatter imidlertid yderligere strukturelle elementer, såsom det membranoverskridende domæne og det helikale domæne (HD), som er afgørende for den korrekte samling af disse proteiner og for deres enzymatiske funktion.

Med kloningen af den første pattedyr-AC kom antydningen af, at AC’er kan ligne transportører (9). Tidlige undersøgelser af AC’er i Paramecium tydede på, at TM-delen af proteinet kan have en ionkanalfunktion (10). I overensstemmelse med deres kanalfunktion er sekvensen af Paramecium AC’s TM-del homolog med sekvensen af spændingsstyret kaliumkanaler (11). Tilstedeværelsen af et polytopisk TM-helixbundt og det cytosoliske adenosin 5′-triphosphat (ATP)-bindende domæne tyder på en overfladisk strukturel og funktionel lighed med ATP-binding kassette (ABC)-transportører. Der er imidlertid ikke nogen væsentlig sekvensmæssig lighed mellem AC’er og nogen kendte transportørlignende eller ionkanallignende proteiner. Undersøgelser af mykobakterielle og pattedyrs AC’er indikerede en mulig rolle for TM-domænerne i den korrekte samling af enzymet (7, 12, 13). Den strukturelle og funktionelle rolle af TM-regionen er imidlertid fortsat uklar.

AC9 er en cyklase-subtype, der udtrykkes i mange væv, herunder lunge, hjerne og hjerte (14, 15). Den er blevet udførligt undersøgt i forbindelse med A-kinase forankringsprotein (AKAP) komplekser (16). Det er blevet foreslået, at AC9 er forbundet gennem AKAP Yotiao med IKs-kaliumkanaler, proteinkinase A, fosfodiesterase PDE4D3 og proteinfosfatase PP1 (17). AC9 er blevet identificeret som et potentielt lægemiddelmål i astma (5). rs2230739, en polymorfi af AC9, der resulterer i en Ile772→Met-mutation, er forbundet med ændringer i responsen på det inhalerede kortikosteroid budesonid (18). I en kanonisk model for AC-aktivering binder forskolin til et allosterisk sted, der støder op til det katalytiske sted, hvilket fører til aktivering af enzymet. Interaktion mellem AC og Gαs-underenheden i en guanosin 5′-triphosphat (GTP)-bundet tilstand fører også til AC-aktivering, med maksimal AC-aktivering opnået i tilstedeværelse af både forskolin og Gαs-proteinet. Men selv om sekvenssammenligninger med andre AC’er viser, at AC9 indeholder et allosterisk sted, og en tidligere rapport antydede, at forskolin kan aktivere AC9 (14), konkluderede flere undersøgelser, at AC9 er forskolinuafhængig, og konsensus på området har været, at AC9 står i sin egen kategori som et forskolinuafhængigt protein (19, 20).

AC’erne har længe været en manglende brik i vores forståelse af signaltransduktion, muligvis på grund af de anerkendte vanskeligheder med at udtrykke og rense disse proteiner med henblik på biokemiske og strukturelle undersøgelser (21). For at udfylde dette hul, bestemte vi strukturen af bovin AC9 i kompleks med Gαs (AC9-Gαs) ved hjælp af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) og enkeltpartikelanalyse.

Vi udtrykte og oprensede bovin AC9 (fig. S1A) og bekræftede dens funktionelle integritet ved hjælp af cAMP-akkumulationsassays (Fig. 1, A til C). Det oprensede protein katalyserede omdannelsen af ATP til cAMP og kunne hæmmes af MANT-GTP (2ʹ-/3ʹ-O-(Nʹ-methylanthraniloyl)guanosin-5ʹ-O-triphosphat), en hæmmende AC-substratanalog (Fig. 1B). Rekonstituering af proteinet med den GTPγS-aktiverede Gαs (fig. S1, B og C) førte til en robust aktivering af cyklasen (fig. 1A). Test af den universelle AC-aktivators forskolins evne til at aktivere AC9 in vitro afslørede en meget svag aktivering af AC9 ved submillimolære koncentrationer (Fig. 1A). Derimod kunne forskolin aktivere AC9-Gαs-komplekset med en median effektiv koncentration (EC50) på 111 μM (Fig. 1A og tabel S2). Selv om både forskolin og Gαs-underenheden således var i stand til at aktivere proteinet delvist, kunne der kun opnås fuld aktivering ved at kombinere de to midler. Som forventet fra en allosterisk modulator af AC’en forskolin forskød forskolin desuden den mediane inhiberende koncentration (IC50) af AC9-substratanaloget MANT-GTP mod den lavere koncentration (Fig. 1, B og C). Derfor viser vores in vitro-eksperimenter ved hjælp af oprenset AC9 i fuld længde og Gαs-protein klart, at forskolin virker på AC9-Gαs-proteinkomplekset som en klassisk allosterisk aktivator.

Vi fremstillede frosne, hydrerede cryo-EM-gitre indeholdende AC9-Gαs-komplekset i tilstedeværelse af MANT-GTP og forskolin ved koncentrationer (0,5 mM for hver ligand), der overstiger IC50- og EC50-værdierne for disse to forbindelser, og underkastede dem cryo-EM-analyse med enkeltpartikler (fig. S2). Den bedste delmængde af partikler resulterede i et tæthedskort svarende til det komplette kompleks af cyklasen og G-proteinunderenheden, raffineret til en opløsning på 3,4 Å (Fig. 1D). Det komplette tæthedskort sammen med de kort, der blev opnået efter fokuseret forfining af de membranindlejrede (fig. S3) og cytosoliske (fig. S3) dele af komplekset, gjorde det muligt for os at opbygge en komplet tredimensionel (3D) model af AC9-Gαs komplekset (fig. 1E). Kortet og modellen afslørede flere nøgleelementer i AC9-Gαs-komplekset: (i) AC9’s 12-TM-domænebundt, (ii) HD’en, der forbinder TM-bundtet og det katalytiske domæne af AC9, og (iii) det katalytiske domæne af AC9, bundet til den GTPγS-aktiverede Gαs-underenhed (fig. 1, D og E, og fig. S6).

Proteinets TM-domæne besidder en pseudo-dobbelt symmetri, et træk, der ofte findes i opløselige transportører af modstandsknudeafdelingens, ABC- eller major facilitator-familien (Fig. 2, A til C). Transmembranhelikserne TM1-TM6 og TM7-TM12 kan overlejres med en root mean square deviation (RMSD) på 3,4 Å over 176 rester (Fig. 2D). Den interne pseudosymmetri understøtter hypotesen om, at membran-AC’erne fra pattedyr er opstået ved en gen-duplikeringsbegivenhed fra et simpelt system, muligvis svarende til “halvcyklasen” Cya/Rv1625c fra Mycobacterium tuberculosis (12). Grænsefladen mellem de to TM-hele af AC9 er dannet af helikserne TM1, TM4 og TM6 i den N-terminale “halvdel” af TM-domænebundtet og TM7, TM10 og TM12 i den C-terminale del af proteinet (fig. 2, B og C). Kloningen af det første AC-gen fra pattedyr blev ledsaget af en antydning af, at AC’er kan fungere som transportører, baseret på deres primære sekvens (9). Vores struktur afslører ikke nogen indlysende putativ solutetranslokationsvej inden for TM-domænebundtet, idet TM-helicerne i AC9 er pakket tæt sammen. Selv om en digitonin-micelle sandsynligvis giver et miljø, der ligner lipiddobbeltlagets, er det muligt, at TM-helicernes konformation i membranens fysiologiske miljø er anderledes.

De TM6- og TM12-helixer af AC9 strækker sig ind i cytosolen og danner 40-residue-lange HD’er, der her betegnes HD1 (herunder helixer h1.1 og h2.1) og HD2 (helixer h2.1 og h2.2; Fig. 2, E og F). Denne region er vigtig for funktionen af AC’er og guanylylcyklasser i prokaryoter og eukaryoter (12). Residualerne Leu323 til Met333 i helix h1.1 og Ile1022 til Leu1032 i helix h2.1 danner en klassisk spiralformet spole (Fig. 2F). Vi har tidligere beskrevet HD af Cya, en membran-AC fra Mycobacterium intracellulare, der er homolog med M. tuberculosis Rv1625c (12). AC9 HD’en viser nogle forskelle i forhold til Cya i den relative placering af kerneområdet ved grænsen til det katalytiske domæne (Fig. 2, E og F, og fig. S7, A og B). I M. intracellulare Cya er de korte helikser tæt bundet ved C terminus af den oprullede spole (fig. S7B). I modsætning hertil afvikles den oprullede spole i AC9 ved de C-terminale ender af h1.1 og h2.1 (fig. 2F, fig. S7B og fig. S8A). Denne region af enzymet er kritisk for funktionen af AC’er og guanylylcyklasser. Genetiske sygdomsrelaterede mutationer er kortlagt til AC5’s HD’er i familiær dyskinesi og facial myokymi (22, 23) og til mutationer i retinal guanylylcyclase (retGC1) i Lebers medfødte amaurose-1 (24) og kegle-rod dystrofi-6 (CORD6) (25). Vi kan nu præcisere positionerne for de sygdomsrelaterede mutationer ved hjælp af strukturen af AC9 fra kvæg, som er en meget tættere tilnærmelse til de menneskelige patologibundne nukleotidylcyklasser sammenlignet med M. intracellulare Cya.

Funktionen af 12-TM-bundlen i pattedyrs AC’er har været uklar. Nylige undersøgelser af det mykobakterielle Rv1625c antydede en mulig receptorfunktion for den membranoverskridende region af det mykobakterielle homolog (12). Vi kunne ikke opløse dele af den ekstracellulære overflade af AC9 (Fig. 2, A og B), og det er ikke klart, om den membranbundne del af proteinet rummer funktionelt relevante bindingssteder for hypotetiske ligander. På samme måde kunne C1b-domænet, der forbinder det katalytiske domæne C1a med TM7, ikke opløses i vores rekonstruktion (fig. S6, E til G). Vores struktur giver imidlertid fingerpeg om, hvordan interaktioner med den membranoverskridende region kan påvirke proteinets katalytiske funktion. Helicerne TM6 og TM12 er kontinuerlige med h1.1 og h2.1 i HD. TM6 og TM12 er placeret ved grænsefladen mellem TM1-TM6- og TM7-TM12-helikale bundter og er lateralt eksponeret mod lipiddilaget (fig. 2E og fig. S8B). Det er tænkeligt, at direkte interaktioner af TM6 eller TM12 med lipider, små molekyler eller andre proteiner kan påvirke det katalytiske domæne direkte ved at ændre orienteringen af helikserne h1.1 og h2.1 (fig. S8B).

Det komplette katalytiske AC9-domæne består af to halvdele, C1a og C2a (fig. 1E og 3A), svarende til de tidligere opløste røntgenstrukturer af de opløselige domæner af membran-AC’er (fig. S7, A og C). Som det tidligere er vist, dannes den vigtigste interaktionsgrænseflade mellem G-protein α-underenheden og det katalytiske AC9-domæne af indsættelsen af Gαs Switch II-helixen i den rille, der dannes af helicerne α′2 og α′3 i AC9 C2a-domænet (fig. S7, D til F). HD-regionen h1.2 (rest 340 til 360) er i nærheden af den Gαs-interagerende overflade (fig. S7E). Denne region af proteinet synes at være meget dynamisk, og vi kunne ikke opløse de rester, der forbinder His361 og Pro384 i AC9 (fig. S7E). Ikke desto mindre tyder nærheden af dette område til G-protein-AC-grænsefladen på, at dette element i AC9-strukturen sandsynligvis bidrager til interaktionen mellem AC9 og Gαs.

Et element med stærk tæthed placeret inden for ATP-bindingsstedet og forskolin-stedet blev påvist (fig. 3, A og B, og fig. S9, A til C). Denne tæthed viste overfladisk lighed med MANT-GTP-tætheden, men stemte ikke overens med dens forventede placering (fig. 3A). Tætheden i forskolin-stedet syntes at overlappe med den forventede placering af forskolin (Fig. 3A). En lignende tæthedsfunktion var til stede i kortet rekonstrueret fra billeder af prøven uden forskolin (Fig. 3B og fig. S9B). Uafhængigt af tilstedeværelsen af MANT-GTP og/eller forskolin synes de aktive og allosteriske steder derfor at være besat af en tæthed, der stemmer overens med et peptid (fig. 3, A og B, og fig. S9, A og B). Fokuseret 3D-klassifikation og -forfining afslørede en forbindelse mellem denne tæthed og den C-terminale region af C2a-domænet af AC9 (Fig. 3C og fig. S3 og S9C). Selv om tæthedstrækningerne i denne mindre befolkede 3D-klasse (SOL-C-kort, beregnet med kun 16 343 partikler) ikke er tilstrækkeligt stærke til, at vi med sikkerhed kan opbygge en atomar proteinmodel, kunne vi ved at bruge den tilgængelige tæthed som en begrænsning tildele den til resterne Cys1246 til Pro1275 i AC9’s C-terminus eller C2b-domæne (Fig. 3C og fig. S9C). Den høje kvalitet af tætheden inden for det allosteriske og det aktive sted (fig. 3A og fig. S9, A og D) gjorde det muligt for os at opbygge modellen af det okkluderende peptid, der svarer til resterne Ile1263 til Pro1275 i C2b-domænet af AC9 (fig. S9D). Denne region er stærkt konserveret blandt homologerne af AC9 hos hvirveldyr (fig. S9E), men ikke i de andre AC-isoformer (AC1 til AC8) (fig. S10).

For at bestemme C2b-domænets funktionelle rolle i AC9 sammenlignede vi de enzymatiske egenskaber af wild-type og det trunkerede protein uden C2b-domænet AC91250 (fig. 3D og fig. S11A). De to konstruktioner viste sammenlignelig evne til at konvertere ATP til cAMP, med lignende Michaelis-konstant (Km) og Vmax-værdier (Fig. 3E og tabel S2). AC91250 blev aktiveret af forskolin og hæmmet af MANT-GTP på en måde, der lignede AC9’s (fig. S11, B til D). Tilsætning af Gαs stimulerede potent cAMP-produktion af AC9 (Fig. 3F), med en samtidig stigning i dens Km for ATP. I overensstemmelse med halen, der hæmmer ATP-binding, viste AC91250 en høj Vmax, men ved en meget lavere Km-værdi (Fig. 3F). Dette er en stærk indikation af, at C2b-regionen spiller en funktionel rolle i den G-proteinbundne tilstand af AC9. Fjernelse af C2b-regionen øger AC9’s affinitet for ATP i tilstedeværelse af Gαs, hvilket gør det muligt for proteinet at nå en maksimal katalyseringshastighed ved meget lavere ATP-koncentrationer. Reduktion af affiniteten for substratet (ATP) ved at C2b-domænet lukker det aktive sted af for C2b-domænet, kan udgøre en reguleringsmekanisme til kontrol af cAMP-produktionen af det G-proteinbundne AC9.

For at vurdere konformationsændringerne i den okkluderede tilstand af AC9 bestemte vi cryo-EM-strukturen af AC91250-Gαs-komplekset i tilstedeværelse af MANT-GTP og forskolin (AC91250-Gαs-MF; Fig. 3, G og H, og fig. S12 og S13). Rekonstruktionen ved 4,2-Å-opløsning gav os mulighed for klart at opløse tætheden for MANT-GTP og forskolin bundet ved deres kanoniske bindingssteder (fig. 3, G og H, og 4; fig. S13, E til G). Sammenligning af det katalytiske domænearrangement af AC91250-Gαs-MF- og AC9-Gas-komplekserne afslørede en lille relativ omarrangeringen af C1a afhængig af tilstedeværelsen af det okkluderende peptid i de aktive og allosteriske steder (Fig. 4, A og B); RMSD mellem atomerne i de mobile C1a-domæner (Ile1380 til Gln574) i de to sammenlignede strukturer, der er justeret ved hjælp af deres C2a-domæner (Gln1049 til Lys1245), er 1,9 Å. Den subtile bevægelse af hele domænet, der er observeret i den okkluderede tilstand af AC9, forskyder de aminosyrerester af C1a, der er involveret i nukleotidbinding, med ~3 Å (fig. S13H). Derfor antager det centrale katalytiske domæne af AC9 en okkluderet konformation, hvor det C2b-afledte peptid besætter proteinets aktive og allosteriske steder (fig. S9, D og E) samtidig med en forvrængning af det aktive sted sammenlignet med den, der er observeret i MANT-GTP- og forskolin-bunden tilstand.

Strukturen af AC9-Gαs-komplekset i en okkluderet konformation gav os mulighed for at genoverveje den etablerede model for cAMP-baseret signaltransduktion (7, 26) (fig. S14). Aktivering af GPCR-kaskaden skal føre til dannelse af den Gαs underenhedsbundne form af AC’en for at generere cAMP. Den okkluderede tilstand, der er beskrevet her, tilføjer imidlertid et mellemprodukt, som ikke tidligere er blevet værdsat. Den okkluderede tilstand og den aktive tilstand af AC9 eksisterer sandsynligvis i en ligevægt; den prøve, der producerede rekonstruktionen af den okkluderede tilstand, kan aktiveres af G-protein og kan producere cAMP. Proteinets væsentligt reducerede Km for ATP (Fig. 3F) tyder yderligere på, at okklusion af ATP-stedet kan være begunstiget i tilstedeværelse af G-proteinet. Fremtidige eksperimenter vil bidrage til at definere den funktionelle rolle af denne proteinkonformation i den katalytiske cyklus af AC9.

Arkitekturen af AC9, der er afsløret i denne undersøgelse, giver ledetråde til den mulige rolle af de membranindlejrede dele i pattedyrs AC’er. En tilsyneladende funktion af membrandomænet er at muliggøre den korrekte samling af den aktive cyklase. Dette opnås ved at TM6 og TM12 danner rammen for HD’en. Det er sandsynligt, at de elementer af proteinet, der ikke på nuværende tidspunkt kan opløses, dvs. N-terminus og C1b-domænet, bidrager til samling og regulering af AC9’s cyklasefunktion (fig. S6, E til G). På trods af adskillelsen af det katalytiske domæne med ~40 Å fra lipiddobbeltlaget er det derfor tænkeligt, at membrandelen af proteinet kan påvirke det katalytiske domæne via HD og loop-regionerne, der støder op til det.

Den okkluderede tilstand af komplekset med det C-terminale peptid, der binder både det aktive og det allosteriske sted i AC9, kan repræsentere en vigtig autoregulerende mekanisme, der er indbygget i det AC-baserede signaltransduktionsmaskineri. Tilstedeværelsen af peptidet kan være med til at forklare de inkonsekvente observationer af forskolin-insensitivitet af AC9 (14, 19, 20), hvilket understøtter kontekstafhængig autoregulering af AC9. Forskolin er en planteafledt småmolekylær aktivator af AC’er; det er blevet postuleret, at der findes en naturlig aktivator eller inhibitor af dette sted i AC’erne (20), men er indtil videre ikke blevet identificeret. I tilfældet AC9 kan vi nu vise, at (i) forskolin er i stand til at aktivere enzymet, og (ii) den sandsynlige naturlige regulator af det allosteriske sted er den del af C2b-domænet, der binder sig til proteinets aktive region. Vi foreslår, at C2b efter aktivering af G-proteinet (fig. S14, A til D) okkluderer AC9-reaktionscentret og blokerer den enzymatiske aktivitet, hvilket forhindrer overdreven produktion af cAMP i cellen (fig. S14E). Dette er i overensstemmelse med en nylig rapport om den autoinhiberende funktion af AC9 C2b-domænet af AC9 i en cellulær sammenhæng (27). Vores resultater kan være med til at bane vejen for at generere nye tilgange til lægemiddelopdagelse, der udnytter den autoregulerende molekylære mekanisme, der er afsløret af AC9-Gαs struktur.