TEKST
Humane influenzavirus inficerer normalt det øvre luftvejssystem og forårsager nysen, løbende næse og hoste samt feber, utilpashed og arthralgier (22). Desuden er der også blevet rapporteret om neurologiske komplikationer, når en ny undertype af influenzavirus introduceres i den menneskelige befolkning, som eksemplificeret ved de spanske (1918) og asiatiske (1957) pandemier (2-4, 6, 10, 18, 22).
I 1997 forårsagede H5N1-influenzavirus, som stammede fra fjerkræ, et udbrud hos mennesker. Siden da er mere end 500 mennesker blevet smittet med H5N1-virus på verdensplan med en dødelighed på ca. 60 % (21). H5N1-virusinfektion hos mennesker viser sig generelt som alvorlig lungebetændelse, der udvikler sig til akut åndedrætsnødssyndrom; nogle ofre for H5N1-virus har dog haft neurologiske symptomer (1). H5N1-virus-RNA og antigener er blevet påvist i patienters hjerner, og selve virusset er blevet isoleret fra cerebrospinalvæske (5, 7) Disse data tyder på, at nogle H5N1-virus kan forårsage hjernebetændelse hos mennesker, som det skete i de tidlige faser af de spanske og asiatiske pandemier.
Freder udgør en nyttig pattedyrmodel for influenzainfektion, fordi de er meget modtagelige for infektion med influenzavirus og udvikler nogle af de symptomer på influenza, som ses hos mennesker (8, 12, 14, 16, 19). Der er også rapporteret om neuroinvasivitet af et H5N1-influenzavirus efter intranasal eksponering i en fretmodel (23). For at undersøge de langsigtede neurologiske virkninger af H5N1-virusinfektion på lang sigt inficerede vi derfor fritter med H5N1-virus, der forårsager milde symptomer hos disse dyr, og observerede virkningerne på centralnervesystemet (CNS) i 9 måneder. Vi forsøgte også at klarlægge, ad hvilken vej disse H5N1-virus invaderede CNS.
Seks måneder gamle fritter blev inokuleret intranasalt med 106 PFU af A/Hong Kong/483/1997 (H5N1; HK483) eller A/Hong Kong/486/1997 (H5N1; HK486) virus. Disse vira blev opformeret i Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-celler i minimalt essentielt medium suppleret med 0,3 % bovin serumalbumin. På dag 3, 6 og 12 og i månederne 1, 3, 6 og 9 efter infektionen (p.i.) udtog vi vævsprøver med henblik på virusisolering og patologisk undersøgelse. Fritterne var sløve og udviste tegn og symptomer på luftvejsinfektion i løbet af de første 10 dage p.i., men manglede nævneværdige neurologiske tegn, hvilket står i modsætning til tidligere rapporterede resultater (23). Vævsprøver fra næsehorn, lunger, luftrør, hjerne, lever, milt, nyrer, hjerte, bugspytkirtel og rygmarv blev høstet og homogeniseret til en 10 % suspension med fosfatbufferet saltvand. Virustiteren i hvert væv blev bestemt ved hjælp af plaque-assays. Virusene replikerede hovedsageligt i næseborene med virustitere på 105 til 106 PFU/gram væv efter 3 til 6 dage p.i. (tabel 1). Hjernevæv indsamlet fra HK483- eller HK486-inficerede fritter blev konserveret i 10% neutralt bufferet formalin og behandlet med henblik på paraffinindlejring. De paraffinindlejrede væv blev skåret i 5 mm tykke skiver og farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E). Yderligere sektioner blev skåret til immunohistologisk farvning med kanin-polyklonale antistoffer mod et H5-influenzavirus. Histologisk undersøgelse afslørede neuronal invasion eller beskadigelse, herunder inflammation af plexus choroidus (tabel 2). Fritter, der var inficeret med HK486-virus, viste tegn på ikke-suppurativ inflammation (fig. 1a) og viral antigenekspression (fig. 1b), der varede i 12 dage; virale antigener blev ikke påvist i 1 måned p.i. Den ikke-suppurative encephalitis varede i 3 måneder (fig. 1c), med resterende glial ardannelse synlig i 6 og 9 måneder p.i. i de områder, hvor virale antigener blev påvist i den tidligere fase (fig. 1d). Endvidere viste fritter, der var inficeret med HK486, makroskopisk skade på lugtesystemet på dag 12 p.i. (fig. 1e og f). Disse resultater tyder på, at selv om højpatogene H5N1-virus hovedsagelig påvirker værtens luftveje (1), kan de også forårsage neurologiske komplikationer. I modsætning til HK486-virus, som invaderede fritternes hjerneparenkym og forårsagede alvorlige parenkymskader, forårsagede den anden H5N1-stamme, HK483, alvorlig ikke-suppurativ vaskulitis uden synlige parenkymskader i fritternes hjerner ved 6 dage p.i. Selv om viralt antigen ikke kunne påvises i vaskulaturen, var der tydelig vaskulær skade, som var karakteriseret ved endothelial hævelse (Fig. 2a, pilespidser), spredte apoptotiske celler (Fig. 2b, pilespidser) og intramural infiltration af makrofager (Fig. 2a, pile) og polymorphonukleære leukocytter (Fig. 2b, pil). Der blev fundet vaskulære læsioner i thalamus, ved overgangen mellem den grå og hvide substans og i hjernestammen. Hjerneprøver, der blev undersøgt efter 1 og 6 måneder p.i., viste hæmoragiske læsioner, der indikerede kronisk og gentagen perivaskulær blødning (Fig. 2c) i thalamus, cerebellum og subaraknoidalrummet i forhjernen (Fig. 2d). Disse observationer er i overensstemmelse med rapporter om influenzavirusinducerede hæmoragiske hjernekomplikationer under årlige epidemier (11). Vaskulitis i hjernen sekundært til virusinfektion er relativt almindelig (17) og er sandsynligvis årsag til skrøbelighed af karvæggen, hvilket fører til hjerneblødning. Det synes derfor rimeligt at konkludere, at H5N1-virusinfektion hos mennesker kan forårsage hjerneblødning svarende til den, der ses ved infektion med andre neurotrope vira.
- Se inline
- Se popup
Virusgenvinding fra væv fra fritter, der er inficeret med HK483- eller HK486-H5N1-virus
- Vis inline
- Vis popup
Prevalens af hjernelæsioner hos fritter på forskellige tidspunkter efter infektion med højpatogene H5N1-influenzavirusa
Hjernelæsioner hos HK486-virusinficerede fritter. (a) Alvorlig ikke-suppurativ encephalitis i det olfaktoriske område på dag 6 efter infektionen (p.i.). (b) Viral antigenekspression i en hjernelæsion på dag 12 p.i. Neuronale og gliaceller er farvet med anti-H5-virus antiserum. (Indsat) Ikke-inficerede neuroner og glia. (c) Smoldende encephalitis i hjernevæv ved 3 måneder p.i. (d) Perivaskulær glial ardannelse ved 9 måneder p.i. (e) Makroskopisk synlig hjernelæsion i en del af det olfaktoriske system (piriform lobe) på dag 12 p.i. (f) Delvis tab af en olfaktorisk pære (øvre side af hjernen ) som følge af viral encephalitis på 1 måned p.i. Sammenlign disse billeder med hjernen fra en aldersmatchet kontrol (nederste hjerne).
Hjernelæsioner hos HK483-virusinficerede fritter. (a) Fremtrædende ikke-suppurativ vaskulitis på dag 6 p.i. Bemærk den kraftige hævelse af en vaskulær endotelcelle (pilespidser) og migration af makrofager ind i karvæggen (pile), sammenlignet med det normale udseende af det omgivende hjerneparenkym. (b) Spredte apoptotiske celler (pilespidser) og polymorphonukleære leukocytter (pil) i karvæggen på dag 6 p.i. (c) Gamle og friske hæmoragiske læsioner i thalamus hos en ilder, der blev nekropseret 6 måneder p.i. (pilespidser, hæmosiderinholdige makrofager i en gammel læsion; pile, frisk blødning med røde blodlegemer). (d) Frisk subarachnoidalblødning i en ilderhjerne på 6 måneder p.i. Bemærk ophobningen af røde blodlegemer mellem leptomeninges (stiplet sort linje) og arachnoid mater (stiplet rød linje).
For at undersøge, ad hvilken vej H5N1-virus invaderer fritternes hjerner, analyserede vi fordelingen af hjernelæsioner og den virale antigenekspression, der blev observeret hos fritter, som var inficeret med HK483-, HK486-, A/Hong Kong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204) og A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18) virusene. HK213-, VN1204- og NCVD18-virusserne blev opformeret i MDCK-celler i minimalt essentielt medium suppleret med 0,3 % bovin serumalbumin. Fritter på seks måneder blev inokuleret intranasalt med 106 PFU af virus. Der blev indsamlet hjernevæv i den akutte fase, 3 og 6 dage efter infektionen for VN1204 og NCVD18 og desuden 12 dage efter infektionen for HK213. Vævene blev behandlet til H&E-farvning og immunohistokemi med henblik på histologisk undersøgelse. De hjerneparenkymlæsioner, der blev produceret af VN1204, NCVD18 og HK213, var karakteriseret ved ikke-suppurativ encephalitis, og ekspressionsmønstret for virale antigener var stort set det samme som for HK486 (data ikke vist). For at forstå den tredimensionelle (3D) fordeling af hjernelæsioner og virale antigener plottede vi dem ved hjælp af 3D-billeddannelse (TRI/3D-SRF2; Ratoc System Engineering Co., Ltd., Japan) af en gul mongoose (Cynictis penicillata) hjerne, hvis arkitektur minder meget om den af ilderhjernen (20). For at visualisere den olfaktoriske bane (dvs. den sensoriske bane for lugtesansen) markerede vi nervebanerne fra olfaktorisk pære til piriform cortex på 3D-billederne som en referenceramme (Fig. 3a, gul; se også Movie S1 i det supplerende materiale). Vi fandt tre forskellige mønstre af hjernelæsioner, med og uden virale antigener, forårsaget af de forskellige H5N1-influenzavirus: dem, der kun er fordelt langs den olfaktoriske bane (Fig. 3b og c, stiplet gul linje; se også Film S2 og S3) (HK213 og NCVD18); dem, der er påvist langs den olfaktoriske bane (Fig. 3d og e, stiplet gul linje; se også film S4 og S5) og i hjernestammen (fig. 3d og e, hvide pile; se også film S4 og S5) (HK486 og VN1204); og dem, der er fundet i andre områder (fig. 3f; se også film S6) (HK483). Grundlaget for at adskille den tredje gruppe af læsioner fra de to andre grupper er mere tydeligt, når læsionsfordelingerne undersøges fra bagtil (Fig. 3g og h, gul versus blå versus rød). Disse kortlægningsresultater viser, at de fleste af de H5N1-stammer, som vi testede, invaderede hjernen via den olfaktoriske vej (fig. 3, stiplet gul linje). En undtagelse var HK483-stammen (Fig. 3f), som klart var rettet mod hjernens vaskulatur hos fritter og producerede læsioner uden for det olfaktoriske system.
Fordeling af hjernelæsioner efter infektion med HK483-, HK486-, HK213-, NCVD18- eller VN1204-stammen af H5N1-virus. Hjerneskaderne er kortlagt på tredimensionale billeder af en gul mongolhjerne. Udvalgte dele af hjerneafsnittene blev analyseret; derfor er plottet af læsionslokaliteterne diskontinuerligt. (a) Olfaktorisk rute (gul). Fordelingen af læsioner og virale antigener (rødt) i forbindelse med HK213 (b) eller NCVD18 (c) infektion følger den olfaktoriske rute (stiplet gul linje). Hos dyr, der er inficeret med HK486 (d) eller VN1204 (e), er læsionerne og de virale antigener placeret i hjernestammen (hvide pile) og den olfaktoriske rute (røde plotter inden for den stiplede gule linje). HK483-stammen (f) forårsagede alvorlige skader på blodkarrene med tydelige hæmorrhagiske læsioner (blå plotter). (g) Bagudvendt billede af lugtesansen (gule plotter). (h) Bagudvendt billede af HK483-inducerede hæmoragiske læsioner (blå) og vaskulitis (rød) uden for olfactory route. Panelerne a til f er ventrale visninger.
Hvor H5N1-virus kan blive pandemiske, skal de sandsynligvis opnå evnen til at vokse godt i den øverste del af menneskets luftveje, hvilket vil føre til effektiv overførsel fra menneske til menneske via nysen og hoste (13, 22). Vores data fra fritter tyder på, at hvis højpatogene H5N1-virus får dette fodfæste hos mennesker, kan de forårsage subkliniske neurologiske komplikationer ved at invadere hjernen via nervevejene eller ved at forårsage hjernevaskulitis. Tidligere er der påvist et H3N2-virus i hjerner fra fritter; mængden af virus i hjernerne var imidlertid lav (mindre end 102,2 log10 50 % æg-infektiøse doser), og der blev ikke rapporteret om tegn på virusantigener i hjernen (23). Vi fandt, at det pandemiske H1N1-virus fra 2009 replikerede mere effektivt i luftvejene hos fritter end et menneskeligt sæsonbetinget H1N1-virus (9, 13, 15) og forårsagede ikke-suppurative olfaktoriske bulblæsioner; vi fandt dog ikke virus i hjerneparenkymet hos disse dyr (data ikke vist). Derfor er invasion af hjerneparenkym, som påvist ved tilstedeværelsen af virale antigener, et karakteristisk træk ved H5N1-virus. Det ville derfor være relevant at foretage retrospektive og prospektive undersøgelser af subkliniske neurologiske komplikationer hos H5N1-virusinficerede patienter. Vores resultater giver anledning til bekymring for, at subkliniske neurologiske komplikationer kan ledsage alvorlige luftvejsinfektioner ved den verdensomspændende spredning af H5N1-virus.