Sanes og Lichtman brugte pronuklear injektion til at indsætte disse Brainbow-konstruktioner i mus. Da de afbildede musens hjerner, fandt de mange flere end 3-4 farver på grund af tandemintegration af flere kopier af konstruktionen (ca. 8 i Brainbow-1.0-mus.) Den kombinatoriske effekt af flere uafhængige rekombinationsbegivenheder fører til en regnbue af farver. Med tre kopier af konstruktet ville man forvente ti farver (se tabellen til højre); i forskellige rapporter har Sanes og Lichtman observeret fra 90-160 forskellige farver som følge af et højere antal kopier. Navnet Brainbow er virkelig passende for denne farverige teknologi.
Optimering af systemet: Brainbow-3
Og selv om Brainbow gav neurovidenskabsfolk det store udvalg af farver, der var nødvendige for at markere individuelle neuroner, led systemet også af en række begrænsninger. For det første var billeddannelse af Brainbow-musvæv en udfordring på grund af lav fluorescensintensitet, der delvis skyldtes fluorophorernes fotoinstabilitet, samt fluorophorernes tendens til at aggregere i neuronernes somata. For det andet tillod systemet ikke analyse ved hjælp af immunfarvning. Selv om de anvendte fluorophorer er fluorescerende forskellige, er deres proteinsekvenser meget homologe, hvilket forhindrer design af antistoffer, der er specifikke for hver fluorophor. For det tredje indeholdt Brainbow-1 og Brainbow-2 hver især en “standardtilstand”; Brainbow-1.0 udtrykker f.eks. RFP, når konstruktionen ikke har gennemgået rekombination. Denne standardtilstand blev udtrykt uforholdsmæssigt meget af et flertal af neuroner, hvilket begrænsede antallet af forskellige farver, der kunne observeres i et givet område.
I 2013 frigav Dawen Cai, et al. en forfinelse af Brainbow-teknologien, Brainbow-3.0, med det formål at overvinde de ovenfor nævnte begrænsninger. Først screenede de en række fluorescerende proteiner for at finde dem med ideelle egenskaber (lav aggregation, høj fotostabilitet og høj stabilitet efter fiksering.) Af de syv resulterende proteiner valgte de tre med lavt niveau af både fluorescens og sekvensoverlapning (koral mOrange2, jellyfish EGFP og sea anemone mKate2.) De genererede derefter med succes specialfremstillede antistoffer til hvert af disse proteiner og bekræftede, at der ikke var nogen krydsreaktivitet, hvilket åbnede døren for immunfarveanalyse. For at opnå en jævn cellemærkning genererede de farnesylerede derivater af de fluorescerende proteiner, som er direkte transporteret til cellemembraner. Membrantrafikken af farnesylerede derivater muliggør mærkning af delikate axonale og dendritiske processer, som ikke tidligere var synlige med Brainbow-1 og -2.
Den generelle struktur af Brainbow-1.0 er bibeholdt i Brainbow-3.0, men med mOrange2, EGFP og mKate2 som fluorophorer; mOrange2 er standardtilstanden. I modsætning hertil viser Brainbow-3.1 og -3.2 ikke standardfluorescens på grund af tilføjelsen af en translationsblokerende STOP-kassette umiddelbart efter promotoren. STOP-kassetten indeholder en mutant YFP, som ikke fluorescerer, men som kan påvises via immunfarvning. Denne funktion gør det lettere at screene Cre-negative Brainbow-mus for at bestemme antallet og typen af celler, hvori konstruktet udtrykkes. Brainbow-3.2’s fotostabilitet er forbedret på grund af tilføjelsen af et woodchuck hepatitis virus post-transkriptionelt regulatorisk element (WPRE), der almindeligvis anvendes til at øge transgene proteinniveauer.
Brainbow-varianter og anvendelser uden for musehjernen
Ud over at forbedre Brainbow-systemet udviklede Sanes og Lichtman også et supplerende Flpbow-konstrukt, der funktionelt ligner Cre-baseret Brainbow, men som styres af FLP/FRT-rekombinase. Når Brainbow og Flpbow er placeret under forskellige promotorer, kan de bruges til at mærke forskellige cellepopulationer.
For at mindske den dyreavl, der er nødvendig for at producere dyr med Brainbow-transgener og Cre, skabte Cai et al. også et Autobow-konstrukt, der indeholder både Cre og XFP’er. Cre-produktion driver rekombination og XFP-selektion, efterfulgt af Cre-selv-eksklusion. Disse konstruktioner opretholdes stabilt gennem mindst seks generationer.
Ud over de neuronale pThy1-Brainbow-konstruktioner har Addgene også to Brainbow adeno-associerede virale vektorer (AAV) til rådighed – AAV-EF1a-BbChT og AAV-EF1a-BbTagBY. Disse konstruktioner indeholder to XFP’er hver på grund af størrelsesbegrænsninger i forbindelse med AAV; co-infektion med begge konstruktioner giver mindst 8 farver. Brugen af AAV giver rumlig og tidsmæssig kontrol uden behov for germlinemodifikation og gør det muligt at anvende Brainbow i en række forskellige arter.
Flere varianter er blevet skabt af andre laboratorier, herunder R26R-Confetti beskrevet i Hugo J. Snippert, et al. (2010) og MAGIC Marker-strategien beskrevet i Karine Loulier, et al. (2014).
I øjeblikket anvendes Brainbow-teknikkerne også til at studere modelorganismer såsom Drosophila og zebrafisk. Brainbow i Drosophila har hjulpet med at kortlægge neurale kredsløb, såsom forbindelser mellem motoriske neuroner og det neuromuskulære knudepunkt. I zebrafisk er metoden blevet meget nyttig til sporing af afstamning; “Zebrabow” blev brugt til at spore udviklingen af hornhindeepitelet.
For forskere, der er interesseret i neurovidenskab og udvikling, er Brainbow et værdifuldt værktøj til at markere og følge enkelte celler på grund af den brede vifte af farver og den høje stabilitet af farver. Sanes og Lichtman anslår, at Brainbows farverige mærkning har mindsket kortlægningstiden for et givet afsnit af hjernen med mindst en størrelsesorden. Det er klart, at yderligere forfinelser af Brainbow-teknikken vil give vigtig indsigt i hjernens og andre biologiske systemers komplicerede fysiske organisering.
Interesseret i at anvende Brainbow i din forskning? Tjek Brainbow-plasmider, der er tilgængelige hos Addgene!
Find Brainbow-plasmider @Addgene:
- Brainbow 1.0, 1.1, 2.1 plasmider
- Brainbow 3.0, 3.1, 3.2 plasmider
Transgene strategier for kombinatorisk ekspression af fluorescerende proteiner i nervesystemet. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62. PubMed.
En teknikerfarvet tilgang til connectomet. Lichtman JW, Livet J, Sanes JR. Nature Reviews Neuroscience. 2008 Jun;9(6):417-22. doi: 10.1038/nrn2391. Epub 2008 Apr 30. PubMed.
Intestinal krypto-homeostase skyldes neutral konkurrence mellem symmetrisk delende Lgr5-stamceller. Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H. Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. PubMed.
Drosophila Brainbow: en rekombinase-baseret fluorescensmærkningsteknik til underopdeling af neurale udtryksmønstre. Hampel S, Chung P, McKellar CE, Hall D, Looger LL, Simpson JH. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):253-9. doi: 10.1038/nmeth.1566. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Flybow: genetisk flerfarvet cellemærkning til analyse af neurale kredsløb i Drosophila melanogaster. Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):260-6. doi: 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Forbedrede værktøjer til Brainbow-værktøjskassen. Cai D, Cohen KB, Luo T, Lichtman JW, Sanes JR. Nature Methods. 2013 maj 5:10(6):540-7. doi: 10.1038/nmeth.2450. Epub 2013 May 5. PubMed.
Zebrabow: multispektral cellemærkning til celleopsporing og lineageanalyse i zebrafisk. Pan YA, Freundlich T, Weissman TA, Schoppik D, Wang XC, Zimmerman S, Ciruna B, Sanes JR, Luchtman JW, Schier AF. Udvikling. 2013 Jul;140(13):2835-46. doi: 10.1242/dev.094631. PubMed.
Multiplex celle- og liniesporing med kombinatoriske mærker. Loulier K, Barry R, Mahou P, Le Franc Y, Supatto W, Matho KS, Ieng S, Fouquet S, Dupin E, Benosman R, Chédotal A, Beaurepaire E, Morin X, Livet J. Neuron. 2014 Feb 5;81(3):505-20. PubMed.
