Variationer i Calvin-Benson-cyklussen: selektionspres og optimering?

Calvin-Benson-cyklussen er grundlaget for kulstoffiksering i alle fotosyntetiske organismer. Man ved imidlertid relativt lidt om, i hvilket omfang dens funktion varierer mellem arter. Ved hjælp af en metode med metabolitprofilering blev der opdaget forskelle i niveauerne af centrale Calvin-Benson-cyklusintermediater blandt C3- og C4-arter. Disse forskelle i metabolitpuljerne blev observeret mellem C3-arter samt mellem C3- og C4-planter. Dette arbejde rejser den interessante mulighed, at forskellige selektionstryk på komponenterne i Calvin-Benson-cyklusen har ført til en uafhængig optimering af den mellem arter.

I 1954 offentliggjorde Melvin Calvin Calvin, Andrew Benson og James Bassham den metaboliske vej, der anvendes til at binde atmosfærisk CO2 – Calvin-Benson-cyklusen (Bassham et al., 1954). Deres grundlæggende opdagelser var baseret på fodring af algen Chlorella med 14C-mærket CO2 og sporing af mærkning af metabolitter over tid (Bassham et al., 1954; Sharkey 2018). De opdagede, at cyklussen består af tre faser: Først fikserer enzymet ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase/oxygenase (Rubisco) CO2 ved hjælp af ribulose-1,5-bisphosphat (RuBP) som acceptor og producerer to 3-kulstofmolekyler, 3-fosfoglycerat (3-PGA). For det andet anvendes ATP og NADPH, der dannes under den fotosyntetiske elektrontransportkæde (fotosyntesens lysafhængige reaktioner), til at fosforylerer og efterfølgende reducere 3-PGA til triosephosphat (triose-P). For det tredje regenereres CO2-acceptoren RuBP gennem en række reaktioner (boks 1). De fleste af de enzymer, der er involveret i denne cyklus, blev opdaget tidligere eller kort efter (Horecker et al. 1951; Racker et al. 1953; Mayoudan et al. 1957). Siden da er det generelt blevet antaget, at driften af Calvin-Benson-cyklusen er meget bevaret blandt forskellige plantearter.

Boks 1.

Calvin-Benson-cyklus

Calvin-Benson-cyklusen består af tre faser: (1) kulstoffiksering, (2) reduktion og (3) regenerering af CO2-acceptoren.

Carboxyleringen sker via ribulose-1,5-bisfosfatcarboxylase/oxygenase (Rubisco), som fikserer CO2 ved hjælp af ribulose-1,5-bisfosfat (RuBP) som acceptor og derved producerer to 3-kulstofmolekyler af 3-fosfoglycerat (3-PGA). 3-PGA fosforyleres efterfølgende af fosfoglyceratkinase (PGK) og reduceres til triosephosphat (triose-P) af glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) i reduktionsfasen. Cyklussen bruger 3 ATP og 2 NADPH pr. molekyle fastgjort CO2. Triose-P kan transporteres ud af kloroplasten for at producere saccharose i cytosolen. Fructose-1,6-bisphosphat-aldolase (FBP ald) kan omdanne triose-P til fructose-6-fosfat (F6P), som er det mellemprodukt, der anvendes til fremstilling af stivelse. Triose-P kan også omdannes til RuBP i en række regenerationsreaktioner for at binde flere CO2-molekyler.

Abkortninger: (FBP), fructose-1,6-bisfosfatase (FBPase), fructose-1,6-bisfosfatase (FBPase), erythrose-4-fosfat (E4P), sedoheptulose-1,7-bisfosfat-aldolase (SBP ald), sedoheptulose-1,7-bisfosfat (SBP), sedoheptulose-1,7-bisfosfatase (SBPase), sedoheptulose-7-fosfat (S7P), transketolase (TK), ribose-5-fosfat (R5P), xylulose-5-fosfat (Xu5P), ribose-5-fosfat-isomerase (RPI), ribulose-5-fosfat-epimerase (RPE), ribulose-5-fosfat (Ru5P), fosforibulokinase (PRK). Enzymer, der katalyserer irreversible reaktioner, er fremhævet med en kraftig fed pil (dvs. Rubisco, FBPase, SBPase og PRK).

I langt de fleste landplanter foregår Calvin-Benson-cyklus sammen med de lysafhængige reaktioner i fotosyntesen primært i mesofylcellerne i bladene. Rubisco diskriminerer imidlertid dårligt mellem CO2 og O2 (Bowes et al., 1971), og fastgørelse af et O2-molekyle i stedet for CO2 resulterer i fotorespiration – en energimæssigt dyr bjærgningsvej for at genvinde RuBP. Efter at den atmosfæriske CO2-koncentration faldt drastisk for 2,3 milliarder år siden (Bekker et al., 2004), udviklede der sig to kulstofkoncentrerende mekanismer, som begrænsede mængden af fotorespiration. Disse ændringer af den grundlæggende fotosyntetiske proces, C4-fotosyntese og Crassulacean Acid Metabolism (CAM), opstod hver især flere gange (Sage et al., 2011). C4-fotosyntese indebærer en rumlig adskillelse af fotosyntesen, således at komponenterne i både de lysafhængige reaktioner og Calvin-Benson-cyklussen forekommer i mesofyl- og bundskedeceller (boks 2). På trods af forskellene i den anatomiske placering af kulstoffiksering har man hidtil kun vidst lidt om, hvordan Calvin-Benson-cyklussens funktion kan være forskellig i C4- og C3-planter og også mellem C3-planter.

Variation i Calvin-Benson-cyklusmetabolitter mellem arter

Calvin-Benson-cyklusen er uden tvivl en af de mest kritiske biokemiske veje på jorden, da den er vejen for kulstofassimilation i planter – hjertet af fotosyntesen. Men kører alle plantearter denne bane på samme måde? Arrivault et al. (2019) har profileret mængden af Calvin-Benson-cyklusmetabolitter fra fem C3-planter (herunder Arabidopsis og flere vigtige afgrøder som ris, hvede og kassava) og fire C4-planter (herunder majs). Samlede metabolitter blev ekstraheret fra modne blade og målt ved hjælp af omvendt fase væskekromatografi koblet til tandem massespektrometri (LC-MS/MS). For at opnå en pålidelig kvantificering blev prøverne tilsat isotopmærkede interne metabolitstandarder; 3-PGA blev kvantificeret enzymatisk. Metabolitprofiler for de forskellige plantearter blev sammenlignet ved hjælp af hovedkomponentanalyse.

Straks opdagede Arrivault et al. (2019) betydelige forskelle i metabolitprofilerne af Calvin-Benson-cyklusintermediater blandt de fem C3-arter, som de undersøgte. Intermediater, der varierede mest, omfattede de absolutte niveauer af 3-PGA, triose-P, ribulose-5-fosfat (Ru5P) og xylulose-5-fosfat (Xu5P). De relative niveauer af RuBP sammenlignet med niveauerne af de intermediater, der er involveret i RuBP-regenerering, varierede fra art til art. Desuden påviste forfatterne variabilitet i de relative niveauer af metabolitpar som f.eks. fructose-1,6-bisfosfat (FBP) og fructose-6-fosfat (F6P), som er forbundet via FBPasens irreversible reaktion, og i metabolitparret sedoheptulose-1,7-bisfosfat (SBP) og sedoheptulose-7-fosfat (S7P), som irreversibelt interkonverteres af SBPase. I de fleste tilfælde adskilte de fem C3-arter sig tydeligt fra hinanden i hovedkomponentanalysen. I hvor høj grad de adskilte sig, var afhængig af, om dataene blev normaliseret i forhold til friskvægt, klorofylindhold eller proteinindhold. Variationen i disse mellemprodukter inden for de fem C3-arter peger på forskelle i den måde, hvorpå planterne kører den samme kulstofbindingsvej. Disse oplysninger har konsekvenser for strategier, der sigter mod at forbedre fotosyntesen. For eksempel kan SBPase begrænse fotosyntesens hastighed (Zhu et al., 2007), og overekspression kan øge den fotosyntetiske effektivitet (Lefebvre et al., 2005; Feng et al. 2007; Ding et al., 2016; Driever et al., 2017). Således kan ændring af aktiviteten af et enkelt enzym i Calvin-Benson-cyklusen påvirke fotosyntesens hastighed og efterfølgende biomasse og udbytte. Det er imidlertid kendt, at effektiviteten af denne tilgang varierer mellem arter. Den allerede eksisterende variation i niveauerne af SBP- og S7P-metabolitterne mellem C3-arter rapporteret af Arrivault et al. (2019) er derfor vigtig og kan give indsigt i fotosyntesens variable respons på at øge mængderne af SBPase.

Da C4-planters kulstofkoncentrationsmekanisme begrænser fotorespirationen, var det måske mindre overraskende, at det første produkt af fotorespiration, 2-fosfoglycolat (2-PG), var mindre rigeligt i C4-arter end i C3-arter. Desuden havde C4-planter lavere niveauer af RuBP end C3-planter, hvilket er i overensstemmelse med deres lavere investering i Rubisco. Selv når 2-PG- og RuBP-niveauerne blev udeladt fra datasættet, blev C3- og C4-metabolitniveauerne imidlertid næsten altid adskilt i hovedkomponentanalysen. Disse forskelle var konsekvente, uanset om dataene blev normaliseret i forhold til friskvægt, klorofylindhold eller proteinindhold, og ændringerne tyder således på, at de enzymer, der er ansvarlige for at generere metabolitterne, foretager katalyse med forskellige hastigheder i de forskellige arter. Forfatterne bruger udtrykket “driftsmodus” for Calvin-Benson-cyklussen til at beskrive disse forskelle – således at cyklussen fungerer forskelligt fra art til art, selv om de samme enzymer er involveret, hvilket fører til de observerede ændringer i de relative niveauer af intermediærstoffer. De foreslår derfor, at forskellene i Calvin-Benson-cyklussen mellem C3- og C4-planter er bredere end en simpel rumlig flytning til bundskedeceller i sidstnævnte og involverer tilpasning i cyklussens driftsmåde.

Fremtidige perspektiver

Det er interessant at fastslå, at Calvin-Benson-cyklussens driftsmåde kan variere, især i betragtning af at strukturen af vejen (i form af involverede enzymer og deres reaktionssekvens i cyklussen) har været meget bevaret. I løbet af de millioner af år, der er gået siden cyklussens første forekomst, har forholdet mellem O2 og CO2 i atmosfæren imidlertid ændret sig dramatisk. Man mener, at disse ændringer har bidraget til, at nogle plantearter har udviklet mekanismer til kulstofkoncentration. Forfatterne foreslår nu, at lave CO2-niveauer i kombination med specifikke miljøforhold kan have ført til udviklingen af forskellige funktionsmåder i Calvin-Benson-cyklusen. Variationen i de observerede metabolitprofiler kan således afspejle forskellige selektionspresset på den måde, Calvin-Benson-cyklusen reguleres på i forskellige planteafstamninger. Den metode, som forfatterne har anvendt til at analysere Calvin-Benson-cyklusintermediater, kan nu anvendes på flere arter, og det ville være særlig interessant, hvis disse dækkede en bredere vifte af plantefamilier på tværs af forskellige miljøer. Dette kunne afsløre, om variationen udelukkende følger fylogenetiske taxa eller specifikke miljøer, som planterne har tilpasset sig.

Dertil kommer, at de C4-planter, der blev analyseret i Arrivault et al. alle udfører NADP-ME-typen af C4-fotosyntese. En lovende linje for yderligere undersøgelser ville således være at undersøge, om lignende ændringer i Calvin-Benson-cyklusintermediater observeres i alle tre typer C4-metabolisme, eller om de er specifikke for NADP-ME-typen.

Dette arbejde er et glimrende udgangspunkt for at opdage, hvordan disse forskellige Calvin-Benson-cyklusformer styres på molekylært niveau. Selv om metabolitprofilering giver mulighed for en uvildig tilgang til at vurdere variationen i niveauerne af mellemprodukter mellem forskellige arter, mangler de underliggende årsager til disse forskelle stadig at blive fastlagt. Variationen mellem arter kan skyldes forskelle i genekspression og efterfølgende proteinaktiviteter, variation i aminosyresekvensen, der påvirker kinetikken, eller posttranslationel regulering af enzymerne. Det skal bemærkes, at næsten alle Calvin-Benson-cyklusenzymer er underlagt i det mindste en eller anden form for redoxregulering, hovedsagelig via thioredoxin (TRX)/ferredoxin (Fd)-systemet (Buchanan og Palmer, 2005; Michelet et al. 2013). Integrationen af disse transkript-, proteinhyppighed- og enzymaktivitetsdata til metabolitniveauerne kan afsløre det molekylære grundlag for variationen. Desuden kan de observerede variationer i metabolitpuljerne også være relateret til krav til visse intermediater, især dem, der trækkes ud af Calvin-Benson-cyklusen. F.eks. kan flux gennem cyklusen påvirkes af udgangsveje for at muliggøre syntesen af stivelse (via F6P), saccharose og isoprenoider (via triose-P), aminosyrer via shikimatvejen (via E4P) samt thiamin og nukleotider (via R5P) (Raines, 2011).

Arrivault et al. (2019) rapporterer interessant variation i, hvordan komponenterne i Calvin-Benson-cyklusen fungerer i forskellige plantearter. Dette vil helt sikkert katalysere yderligere undersøgelser af, hvordan planter har tilpasset denne grundlæggende og ældgamle vej til kulstoffiksering til forskellige miljøer.