Tiere
S. purpuratus wurden in künstlichem Meerwasser bei 14 °C gehalten. L. anatina wurden im Juni 2016 in den Xiangshan-Feuchtgebieten, Xiangshan-Distrikt, Hsinchu-Stadt, Taiwan (GPS-Koordinaten 24.770779, 120.910742 E) gesammelt, auf Eis ins Labor transportiert und dann sofort seziert.
Konstrukte und Plasmide
Um die enzymatische Aktivität von SpAIDLs und LaAIDLs zu bestimmen, wurden entsprechende bakterielle Expressionsvektoren pASK-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID für SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9, LaAIDL1, 2 und HsAID erzeugt. Die offenen Leserahmen der einzelnen SpAIDL wurden aus genomischer DNA durch PCR mit Phusion-Polymerase und Primern mit SpeI- und XhoI-Restriktionsstellen amplifiziert (siehe Tabelle 1). Die PCR-Produkte wurden mit SpeI und XhoI (New England Biolabs) verdaut und in die NheI/XhoI-Stellen von pASK-TadA (ein Geschenk von Dr. Nina Papavasiliou, Rockefeller University, New York) eingefügt, wodurch der offene Leserahmen von TadA ersetzt wurde. Bei SpAIDL9 wurde durch diese Klonierungsstrategie die dritte Aminosäure von Phenylalanin in Serin umgewandelt, und diese F3S-Mutation wurde mit dem Quikchange-Mutagenese-Kit (Stratagene) und den Primern SPA9S3FT/SPA9S3FB in F3 zurückverwandelt (siehe Tabelle 1). HsAID wurde aus einem Plasmid amplifiziert, das menschliches AID in voller Länge enthält (pCDF-AID, ein Geschenk von Dr. Nina Papavasiliou, Rockefeller University, New York). Bei der Klonierungsstrategie wurde die zweite Aminosäure von Aspartat in Alanin umgewandelt, und D2A wurde mit dem Quikchange-Mutagenese-Kit (Stratagene) und den Primern hAIDA2DT/hAIDA2DB in D2 zurückverwandelt (ergänzende Tabelle 1). Das leere pASK wurde durch NheI/XhoI-Verdau von pASK-TadA, Auffüllen der Überhänge mit Klenow-Polymerase und Ligation mit T4-DNA-Ligase (Thermo Scientific) erzeugt. Die offenen Leserahmen der einzelnen LaAIDL wurden aus L. anatina cDNA amplifiziert und in den pJET1.2/blunt-Klonierungsvektor (Thermo Scientific) kloniert. Die offenen Leserahmen von LaAIDLX wurden mit SpeI und XhoI (New England Biolabs) ausgeschnitten und in die XbaI/XhoI-Stellen von pASK_V5-SpAID4a (siehe unten) kloniert, wobei das SpAID4a-Insert ersetzt wurde. Es ist zu beachten, dass die klonierten Fragmente die ursprünglichen Stoppcodons an ihren 3′-Enden enthalten, so dass das exprimierte Protein keinen V5-Tag enthält.
Die Expressionskonstrukte für die Aktivstellenmutanten von SpAIDL1 und LaAIDL1 (SpAIDL1 H86R E88Q, SpAIDL1 H86R E88Q C123A C126A, und LaAIDL1 H81R E83Q H298R E300Q) wurden durch ortsgerichtete Mutagenese aus den jeweiligen Wildtyp- (oder Einzelmutanten-) Plasmiden erzeugt, wobei entweder das Quikchange-Mutagenese-Kit (SPA1H85RE87QT/SPA1H85RE87QB für SpAIDL1 RQ) verwendet wurde, oder durch konventionelle PCR unter Verwendung von 5′-phosphorylierten Primern (SPA1CCAA-P/SPA1CCAAB für den zweiten Satz von Veränderungen in SpAIDL1 RQAA und LaA1H81RE83QB/LaA1H81RE83Q-P und LaA1H298RE300QB/LaA1H298RE300Q-P für SpLaAIDL1 RQRQ), gefolgt von DpnI-Verdau, Ligation zur Zirkularisierung der Produkte und Transformation in kompetente E. coli.
Um das Niveau der rekombinanten Proteinexpression in E. coli zu überwachen, wurden die bakteriellen Expressionskonstrukte pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID erstellt. pASK_V5 wurde durch Anlagerung der Oligonukleotide pASK_V5F/pASK_V5R (ergänzende Tabelle 1), die die V5-Tag-Sequenz enthalten, und deren Ligation in die NheI/SalI-Stellen von pASK-TadA erzeugt. Die pASK-SpAIDLX/LaAIDLX-Plasmide wurden als Vorlagen für die Amplifikation der jeweiligen cDNAs ohne Stoppcodon verwendet, wobei die Phusion-Polymerase und die in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführten Primer zum Einsatz kamen, und in die NheI/XhoI-Stellen (für SpAIDLX- und HsAID-Fragmente) oder XbaI/XhoI-Stellen (für LaAIDLX-Fragmente) von pASK_V5 kloniert. HsAID wurde aus pASK-hAID amplifiziert. Die Sequenzen von SpAIDL9 und HsAID wurden durch diese Klonierungsstrategie erneut verändert und wie oben beschrieben in die korrekten Sequenzen zurückverwandelt.
Genomische DNA-Präparation
Genomische DNA von S. purpuratus und L. anatina wurde mit dem gDNA Spin Kit Tissue (Bioman) nach den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt. Dazu wurden etwa 1 × 106 Coelomocyten von S. purpuratus und 100 mg Gewebe von L. anatina in getrennte Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, in 200 µl Puffer GT (Bioman) mit 200 mg Proteinase K homogenisiert und 30 Minuten bei 60 °C inkubiert, um die Zellen vollständig zu lysieren. Nach Zugabe von 200 µl BG-Puffer (Bioman) wurden die Proben geschüttelt und 20 Minuten bei 70 °C inkubiert. Anschließend wurden 200 µl Ethanol zugegeben und die gesamte Probe auf eine GD-Spin-Säule (Bioman) geladen. Gewaschen wurde mit 400 µl WI-Puffer (Bioman) und 600 µl Waschpuffer durch Zentrifugation bei 10.000×g für 30 s. Anschließend erfolgte die Elution der genomischen DNAs mit 100 µl Elutionspuffer (10 mM Tris pH = 8,0), der auf 60 °C vorgewärmt wurde.
RNA-Präparation und cDNA-Synthese
S. purpuratus Coelomflüssigkeit wurde mit einer Spritze durch die periostomale Membran gezogen und sofort mit einem gleichen Volumen CMSFW-EI (0,53 M NaCl, 10 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 11 mM Na2SO4, 30 mM EDTA, 50 mM Imidazol) gemischt. Die Coelomocyten wurden abgeschleudert und in 800 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman) resuspendiert. Ösophagus, Dünndarm, Dickdarm und Gonaden von S. purpuratus und Pedikel, Verdauungszäkum, Gonade und Darm von L. anatina wurden von einzelnen Tieren seziert. Kleine Stücke der festen Gewebe von S. purpuratus und L. anatina wurden zu 200 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman) hinzugefügt, und die Proben wurden in einem Bullet Blender (Next Advance) mit 0,5 mm ZrO-Perlen homogenisiert. Unlösliche Trümmer wurden abgeschleudert, und der Überstand wurde in frische Röhrchen mit 600 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman) und 200 μg Glykogen als Trägerstoff überführt. Die Gesamt-RNA wurde dann nach dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Zur Entfernung der restlichen gDNA und anderer Verunreinigungen wurde die RNA von S. purpuratus dann entweder mit dem Turbo-DNA-free-Kit (Ambion) oder dem RNeasy mini Kit (Qiagen) weiterverarbeitet. Das Turbo-DNA-free-Kit (Ambion) wurde gemäß dem Herstellerprotokoll verwendet, mit der Ausnahme, dass für den DNase-Verdau zusätzlich MgCl2 (2,5 mM) und CaCl2 (1 mM) hinzugefügt wurden. Das RNeasy mini Kit (Qiagen) wurde gemäß dem Herstellerprotokoll verwendet.
Ungefähr 250-500 ng RNA von S. purpuratus und L. anatina aus jedem Gewebe wurden mit dem ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen) bzw. dem ToolsQuant II Fast RT Kit (Biotools) in cDNA umgewandelt. In beiden Fällen wurden zufällige Hexamere verwendet und die Anweisungen des Herstellers befolgt.
Schnelle Amplifikation der cDNA-Enden
Die 5′- und 3′-Enden der SpAIDL9-Transkripte wurden mit dem SMARTer RACE-Kit (Clontech) und den genspezifischen Primern SPA9CR1, SPA9CR2, SPA9CF1, SPA9CF2 (siehe ergänzende Tabelle 2) gemäß den Anweisungen des Herstellers amplifiziert. PCR-Produkte, die die 5′- und 3′-Enden der Transkripte enthielten, wurden in den pJET1.2/blunt-Klonierungsvektor (Thermo Scientific) kloniert, und einzelne Klone wurden vollständig sequenziert.
Sequenzanalyse der SpAIDL-Gene
Genomische DNA von drei S. purpuratus-Individuen (Sp105, Sp111, Sp112) wurde als Vorlage verwendet, um die offenen Leserahmen von SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9 mit Phusion-Polymerase und den in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführten Primern zu amplifizieren. Die PCR-Produkte wurden in den pJET1.2/blunt Klonierungsvektor (Thermo Scientific) kloniert. Die Plasmide wurden mit dem Tools mini plasmid kit (Biotools) gereinigt und einem kommerziellen Service (Genomics Taiwan) zur Sequenzierung übergeben, wobei entweder die pJET1.2 Vorwärts- oder die pJET1.2 Rückwärts-Primer verwendet wurden.
Für jedes Gen wurden mindestens acht Sequenzen von jedem Seeigel gesammelt, und die Primer-Sequenzen wurden vor den Sequenzanpassungen ausgeschlossen. Die Nukleotidsequenzen für jedes Gen wurden zunächst innerhalb jedes S. purpuratus mit CLUSTALW (www.genome.jp/tools/clustalw) ausgerichtet, und die dominanten Sequenzen, die den beiden Allelen entsprechen, wurden dann für den anschließenden Vergleich zwischen einzelnen Seeigeln ausgewählt.
Genexpressionsanalyse
Komplementäre DNA von drei einzelnen S. purpuratus (Sp146, Sp147, Sp148) und zwei einzelnen L. anatina (La1 und La3) wurden als Vorlagen verwendet, um die Expression von entweder SpAIDL1, 2, 3, 4a und 9 oder LaAIDL1 und 2 durch quantitative PCR zu testen. Jede qPCR-Reaktion (10 μl) enthielt 5 μl Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), Primer (0,1 μM) (siehe ergänzende Tabelle 3) und 1 μl der Vorlage, und für jede Probe wurden zwei technische Replikate erstellt. Die qPCR-Reaktionen wurden in einem 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) durchgeführt, wobei ein erster Denaturierungsschritt bei 95 °C für 20 s erfolgte, gefolgt von 40 Zyklen von 3 s bei 95 °C und 30 s bei 60 °C. Zur Bestimmung der Genexpressionswerte wurden Standardkurven und zur Normalisierung Hauskeeping-Gene (Sp18S für S. purpuratus und LaRPL39 für L. anatina) verwendet.
Bakterielles Infektionsmodell
Vibrio diazotrophicus wurde in Flüssigkulturen in Difco-Marine-Bouillon (Becton Dickinson) bei 30 °C und 250 U/min über Nacht angezogen. Sechs gesunde Seeigel wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und in zwei Gruppen aufgeteilt, eine Versuchsgruppe und eine Kontrollgruppe. Jedem Tier wurde bei t = 0 ein Aliquot der Coelomflüssigkeit (0,5 ml) entnommen. Den Seeigeln der Versuchsgruppe wurde eine Suspension von lebenden Vibrio diazotrophicus in 200 µl sterilem künstlichen Meerwasser injiziert, wobei die Bakterienmenge für jeden Seeigel so eingestellt wurde, dass sie 106 Zellen/ml des Gesamtvolumens der Coelomflüssigkeit entspricht. Der Kontrollgruppe wurden 200 µl steriles Meerwasser injiziert. Nach t = 6, 24 und 48 Stunden wurden von jedem Tier in jeder Gruppe 200 µl Coelomflüssigkeit entnommen. Aus den zu jedem Zeitpunkt gewonnenen Coelomozyten wurde RNA extrahiert, und aus den t = 0-Proben wurde ebenfalls genomische DNA hergestellt. Die Primerpaare für die Genexpressionsanalyse (ergänzende Tabelle 3) wurden zunächst an den genomischen DNA-Proben getestet, um sicherzustellen, dass sie das jeweilige Gen von jedem Individuum amplifizieren können, trotz der beachtlichen Polymorphismusniveaus in ihrer Sequenz innerhalb der S. purpuratus-Population (siehe Abb. 1b). Quantitative RT-PCR (wie oben beschrieben) wurde zur Messung der Genexpressionswerte mit mindestens zwei technischen Wiederholungen pro Probe verwendet. Die Expressionswerte wurden zunächst auf die 18S-Werte in jeder Probe und dann auf die Werte bei t = 0 für jedes Tier normalisiert. Für die Versuchs- und Kontrollgruppe wurden drei biologische Wiederholungen verwendet, und alle Datenpunkte sind angegeben.
CDA-Assays mit Kanamycin-Resistenzreporter
Ein optimiertes Protokoll eines weit verbreiteten Assays zur Messung von Polynukleotid-CDA-Aktivitäten26 wurde verwendet. Das pTAC-Kan-Desaminase-Reporterplasmid, das eine L94P-Punktmutation im KanR-Gen enthält, und einzelne pASK-SpAIDLX/LaAIDLX-Expressionsvektoren wurden nacheinander in den UNG-defizienten BH156-E.coli-Stamm transformiert. Der menschliche AID-Expressionsvektor pASK-HsAID und der leere pASK-Vektor dienten als Positiv- bzw. Negativkontrollen. Für den Deaminase-Assay wurden mindestens acht einzelne Kolonien für jede mutmaßliche Deaminase in LB-Bouillon (mit 50 μg/ml Ampicillin (Amp), 50 μg/ml Spectinomycin (Spc) und 17 μg/ml Chloramphenicol (Cam)) gezüchtet, bis die optische Dichte bei 600 nm 0,3 erreichte. Jede Kultur wurde dann in zwei Hälften geteilt. Während IPTG (1 mM) zu beiden Kulturen hinzugefügt wurde, wurde Anhydrotetracyclin (AHT) (0,2 μg/ml) nur zu einer der Kulturen hinzugefügt, um die Expression von SpAIDLX/LaAIDLX zu induzieren. Nach einer Inkubation von 3 Stunden bei 37 °C und 200 U/min wurden die Kulturen abgeschleudert, mit PBS gewaschen und auf LB-Platten ausgebracht, die entweder 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc und 17 μg/ml Cam oder 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc, 17 μg/ml Cam und 30 μg/ml Kanamycin (Kan) enthielten. Die Reversionshäufigkeiten wurden als Verhältnis zwischen der Anzahl der KanR-Kolonien und der Gesamtzahl der Kolonien auf der Amp+Spc+Cam-Platte berechnet. Die relative Reversionshäufigkeit wurde dann als Verhältnis der Reversionshäufigkeiten eines Paars identischer Bakterienkulturen bestimmt, bei denen die KanR-Transkription mit IPTG entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit der Deaminase-Expression induziert wurde. Um zu bestätigen, dass die KanR-Kolonien tatsächlich das Ergebnis einer DNA-Desaminierung waren, wurden die pTAC-Kan-Plasmide aus mehreren Kolonien gereinigt und die Reversion des Stoppcodons durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
CDA-Assays mit rpoB als Reporter
Ein optimiertes Protokoll eines weit verbreiteten Assays zur Messung der CDA-Aktivitäten von Polynukleotiden35 wurde verwendet. Einzelne pASK-Expressionsvektoren der wirbellosen Deaminasen wurden separat in UDG-defiziente BH156 E. coli transformiert. Vier ml LB-Medium mit 100 µg/ml Amp, 17 µg/ml Cam und 0,3 µg/ml AHT wurden mit einzelnen Bakterienkolonien angeimpft. Die Kulturen wurden 24 Stunden lang bei 37 °C und 230 U/min gezüchtet, Aliquots wurden auf LB-Agarplatten mit 100 µg/ml Amp oder 100 µg/ml Rifampicin plattiert und über Nacht bei 37 °C gezüchtet. Die Kolonien wurden gezählt, und die Reversionshäufigkeit wurde als Verhältnis zwischen der Anzahl der RifR-Kolonien und der Anzahl der AmpR-Kolonien aus derselben Kultur berechnet. Kulturen, die HsAID exprimierten oder den leeren pASK-Expressionsvektor enthielten, dienten als Positiv- bzw. Negativkontrollen. Es wurden mindestens acht Kulturen pro Expressionskonstrukt getestet. Um die Identität der Mutationen im rpoB-Gen von rifampicinresistenten Kolonien zu bestimmen, wurden Kolonie-PCRs von 24 einzelnen Kolonien unter Verwendung der Phusion-Polymerase und des rpoBF/rpoBR-Primerpaars durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden in einem Gel gereinigt und einer Sequenzierung mit dem rpoBF-Primer unterzogen. Mutationen wurden durch Vergleich mit der WT-Sequenz (Genbank acc. CP024859.1, nt 2321219-2321797) identifiziert.
Proteinexpression von wirbellosen Deaminasen in E. coli
Für die Überwachung des Expressionsniveaus von SpAIDLX/LaAIDLX in den Deaminase-Assays wurde pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX in UNG-defizientes BH156 transformiert. Einzelne Kolonien wurden in LB-Bouillon (mit 50 μg/ml Amp, 50 μg/ml Spc und 17 μg/ml Cam) gezüchtet, bis die optische Dichte bei 600 nm 0,3 betrug. IPTG (1 mM) und AHT 0,2 (μg/ml) wurden der Kultur zugesetzt, um die Proteinexpression zu induzieren. Nach 3 Stunden Inkubation (37 °C, 200 U/min) wurden die Kulturen pelletiert und mit PBS gewaschen. Die Pellets wurden in 2x SDS-Probenpuffer lysiert, zehnfach verdünnt und auf zwei 10%igen SDS-PAGE-Gelen getrennt. Während ein Gel mit Coomassie-Blau angefärbt wurde, um festzustellen, ob gleiche Mengen an Proteinen geladen waren, wurde das andere Gel durch halbtrockenen Transfer auf PVDF-Membranen übertragen und V5-markierte Deaminasen wurden mit einem primären Maus-Anti-V5-Antikörper (Abcam, ab27671) und einem an Meerrettichperoxidase gekoppelten sekundären Kaninchen-Anti-Maus-Antiserum (Jackson ImmunoReasearch) nachgewiesen. Die Chemilumineszenzsignale wurden mit dem Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) und einem Röntgenfilm oder einem ChemiDoc Touch (BioRad) Bildgebungssystem visualisiert. Unbeschnittene Bilder aller gefärbten Proteingele und Western Blots sind in der ergänzenden Abb. 5 zu sehen. Alle bakteriellen Expressionsexperimente wurden in zweifacher Ausführung durchgeführt.
Bioinformatik
Sequenzvergleiche mit dem Seeigel-Genom wurden mit BLAST, BLASTP oder BLASTN unter https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi oder www.echinobase.org durchgeführt, wobei entweder die Standardparameter oder der Filter für geringe Komplexität ausgeschaltet wurden. Multiple Sequenzalignments wurden mit CLUSTALW durchgeführt und manuell auf der Grundlage der vorhergesagten sekundären Strukturmerkmale optimiert. Phylogenetische und molekulare Evolutionsanalysen wurden mit MEGA (Version 7)36 durchgeführt.
Datenverfügbarkeit
Die Sequenzdaten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, wurden in Genbank mit den folgenden Zugriffscodes hinterlegt: SpAIDL1 (MH106904, MH106887, MH106888, MH106889, MH106890, MH106891), SpAIDL2 (MH048921, MH048922, MH048923, MH048924, MH048925), SpAIDL3 (MH106892, MH106893, MH106894, MH106895, MH106896, MH106897), SpAIDL4a (MH106905, MH080287, MH080288, MH080289, MH080290), SpAIDL9 (KY241384, KY241385, MH106898, MH106899, MH106900, MH106901, MH106902, MH106903), LaAIDL1 (MH106906), LaAIDL2 (MH106907).