Antiglykämische Wirkung von wasserextrahierbarem Arabinoxylan aus Weizen-Aleuron und -Kleie

Abstract

Die Studien über die Wirkung von Arabinoxylan (AX) Polysacchariden auf die postprandiale Glukosereaktion haben aufgrund der Vielfalt der AX-Strukturen zu gegensätzlichen Ergebnissen geführt. Vier wasserextrahierbare AX-Extrakte (WEAX) aus Weizen-Aleuron und -Kleie wurden verwendet, um (a) die Wirkung von AX auf die Aktivitäten von α-Amylase und α-Glucosidase, (b) den Einfluss der chemischen Zusammensetzung der AX auf ihre Hemmkraft und (c) die Kinetik der Enzymhemmung zu untersuchen. Die α-Amylase-Aktivität wurde durch die Anwesenheit von WEAX-Fraktionen unabhängig von Typ und Konzentration nicht signifikant beeinflusst. WEAX hemmte die α-Glucosidase-Aktivität nur, wenn Maltose als Substrat verwendet wurde, nicht aber Saccharose. Die IC50-Werte von WEAX (- mg/ml) korrelierten stark mit dem Gehalt an Ferulasäure (), dem Verhältnis von Arabinose zu Xylose () und den relativen Anteilen von unsubstituierter (), disubstituierter () und monosubstituierter () Xylose. Das Lineweaver-Burk-Diagramm deutet auf eine nicht-kompetitive Hemmung des Enzyms hin. Somit deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die antiglykämischen Eigenschaften von WEAX auf einer direkten Hemmung der α-Glucosidase-Aktivität beruhen.

1. Einleitung

Die Prävalenz von Typ-2-Diabetes nimmt weltweit zu. Diabetes ist eine chronische Erkrankung, die sich durch einen hohen zirkulierenden Plasmaglukosegehalt auszeichnet. Daher ist das Management der postprandialen Glukose von entscheidender Bedeutung für die Prävention und Behandlung von Patienten mit Typ-2-Diabetes. Interventionsstudien am Menschen haben gezeigt, dass der Verzehr einer an Arabinoxylan (AX) reichen Ernährung den postprandialen Blutzuckerspiegel bei gesunden, glukosetoleranzgestörten und diabetischen Probanden senkt. Im Gegensatz dazu fanden Mohlig und Mitarbeiter keine Auswirkungen auf die Glukosereaktion, wenn gesunde menschliche Probanden mit AX-angereicherten Brötchen gefüttert wurden. Tierstudien haben ebenfalls gemischte Ergebnisse zur Wirkung einer AX-Supplementierung ergeben. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind nach wie vor unklar, aber es wird vermutet, dass lösliche Fasern die Viskosität des Lumens erhöhen und dadurch die Nährstoffaufnahme verzögern. Die scheinbare Viskosität von AX-Lösungen wird durch die asymmetrische Konformation und das Molekulargewicht von AX sowie durch die Polymerkonzentration beeinflusst. Von diesen drei Faktoren scheint die Konzentration der AX die Viskosität am stärksten zu beeinflussen. Die Wirkung von AX auf den Blutzuckerspiegel ist also dosisabhängig. Die scheinbare Viskosität der AX-Lösungen hängt auch von der Scherbeanspruchung ab, so dass eine höhere Scherbeanspruchung zu einer Scherverdünnung führt, wie sie für nicht-newtonsche Flüssigkeiten charakteristisch ist. Neuere Studien deuten darauf hin, dass der Viskositätseffekt von AX durch eine starke Darmperistaltik ausgeglichen werden kann.

Die Molekularstruktur von AX ist komplex und heterogen. AX bestehen aus dem Xylan-Grundgerüst aus () verknüpften β-D-Xylopyranosyl (Xylp)-Resten mit α-L-Arabinofuranosyl (Araf)-Resten, die an C(O)-2 und C(O)-3 und/oder an beiden C(O)-2 und C(O)-3 Positionen an das Xylan-Grundgerüst gebunden sind. Xylosereste können auch durch Glucuronsäure- und/oder Methylglucuronsäure-Bindungen substituiert sein. Ferulasäure- oder Cumarsäurereste sind in C(O)-5-Position mit Arabinoseresten verestert. Das Verhältnis von Arabinose zu Xylose, das Muster der Arabinose-Substitution, der Grad der Feruloylierung und das Molekulargewicht variieren stark zwischen und innerhalb von Getreidekörnern. Arabinoxylane (AX) machen den größten Anteil an Ballaststoffen in Getreidekörnern aus (60-70 %), und ihr Gehalt variiert je nach Quelle oder Kornfraktion. Bei Weizen beträgt der Anteil der AX 1,3-2,7 % (w/w). Aleuron und Perikarp von Weizen enthalten 20 bzw. 45 % AX. Ein Großteil der AX in Weizen ist wasserunlöslich (70-86%).

Nahrungsmäßig verdauliche Kohlenhydrate werden vor ihrer Absorption im Magen-Darm-Trakt zu den monomeren Zuckern, Glucose oder Fructose, hydrolysiert. Stärke wird hauptsächlich durch Speichel- und Pankreasamylase zu Maltose und anderen kurzkettigen Kohlenhydraten verdaut. Die dabei entstehenden Maltose-, Maltotriose- und α-Grenzdextrine sowie Saccharose werden von den α-Glucosidasen der Dünndarmschleimhaut (Maltase-Glucoamylase und Sucrase-Isomaltase) zu Glucose oder Fructose verdaut. An der Zuckeraufnahme im Dünndarm sind hauptsächlich die Transporter GLUT2, GLUT5 und SGLT1 beteiligt. Somit kann eine Verringerung der postprandialen Hyperglykämie durch eine Begrenzung der intestinalen Kohlenhydratverdauung oder -aufnahme erreicht werden. Trotz der enormen Unterschiede in der Struktur von AX wird in den meisten Studien nur sehr wenig oder gar nichts über die Zusammensetzung oder Struktur der verwendeten AX berichtet, was einen Vergleich der Ergebnisse zur Wirkung von AX auf den postprandialen Blutzucker erschwert. Auch über die Wirkung gereinigter, wasserextrahierbarer AX auf kohlenhydratverdauende Enzyme liegen nur sehr wenige Daten vor. In dieser Studie haben wir daher (a) die Wirkung von AX auf die Aktivitäten von α-Amylase und α-Glucosidase, (b) den Einfluss der chemischen Zusammensetzung von AX auf ihre Hemmkraft und (c) die Kinetik der Enzymhemmung untersucht.

2. Materialien und Methoden

2.1. Chemikalien und Reagenzien

Ein handelsübliches Weizen-Aleuron (Grainwise-Weizen-Aleuron) war ein Geschenk von Cargill Limited und Horizon Milling (Wichita, Kansas, USA). Es besteht aus 4,5, 15,2, 7,4 und 2,5 % Lipid, Protein, Asche bzw. Stärke. Die Kleie von rotem Winterweizen wurde vor Ort von Bulk Barn (Winnipeg, Manitoba, Kanada) gekauft. Ihr Feuchtigkeits-, Asche- und Proteingehalt wurde auf 5,8, 5,3 bzw. 11,1 % analysiert. Unmodifizierte Weizenstärke, Maltose, Saccharose, Acarbose, α-Amylase aus Schweinepankreas (EC 3.2.1.1, Typ VI-B), Amyloglucosidase (EC 3.2.1.3) aus Aspergillus und Acetonpulver aus dem Darm von Ratten wurden von Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA) bezogen. Ammoniumsulfat, alle Säuren und organischen Lösungsmittel wurden von Fischer Scientific (Whitby, Ontario, Kanada) bezogen. Das Testkit für Maltose, Saccharose und Glukose (K-MASUG 08/13) wurde von Megazyme International Ireland (Bray, Wicklow, Irland) erworben. Alle verwendeten Chemikalien waren von analytischer oder HPLC-Qualität.

2.2. Herstellung von wasserextrahierbarem Arabinoxylan

Die endogenen Enzyme wurden inaktiviert, indem Weizenkleie- und Weizen-Aleuron-Proben (~200 g) in 2 L wässrigem Ethanol (80%, v/v) bei 85°C unter Rückfluss für 2 Stunden gekocht wurden. Der Überstand wurde verworfen, und der Rückstand wurde über Nacht bei Raumtemperatur in einem Abzug getrocknet. Die wasserextrahierbaren Fraktionen wurden aus der luftgetrockneten Kleie oder dem Aleuron (150 g) bei 45 °C nach der von Izydorczyk und Biliaderis beschriebenen Methode isoliert. Der Wasserextrakt wurde mit α-Amylase (1821 U/L) destabilisiert und mit Celit und Fuller’s Earth entproteinisiert. Das gereinigte Material wurde durch abgestufte Ammoniumsulfat(AS)-Fällung fraktioniert, wobei Fraktionen mit 50 und 75 % AS-Sättigung erhalten wurden. Das gesammelte Material wurde gefriergetrocknet, nachdem es 48 Stunden lang dialysiert worden war (12 kDa Cut-off-Membran). Die wasserextrahierbaren Fraktionen, die aus Weizen-Aleuron gewonnen wurden, wurden mit der Bezeichnung (WA) versehen, gefolgt von der AS-Konzentration, bei der sie gewonnen wurden (WA-f50 und WA-f75). In ähnlicher Weise wurden die aus der Weizenkleie (WB) gewonnenen Materialien als WB-f50 und WB-f75 bezeichnet. Die chemischen und strukturellen Beschreibungen der WEAX-Fraktionen sind in Tabelle 1 dargestellt.

2.3. Inhibition Assay for α-Amylase Activity

Weizenstärke (300 mg) wurde in 15 mL Natriumphosphatpuffer (pH 6,9, 0,1 M) mit 1 mM Calciumchlorid suspendiert und 15 Minuten lang bei 95°C gekocht. WEAX-Fraktionen (40 mg) wurden in 2 mL Natriumphosphatpuffer aufgelöst. Die Proben wurden so verdünnt, dass die Endkonzentration in der Reaktionsmischung 0,0, 0,2, 0,3 und 0,5 % (w/v) betrug. Gleiche Volumina (200 μl) von Stärke und WEAX (oder Kontrolle) wurden gemischt und geschüttelt. Die Stärkehydrolyse wurde durch Zugabe von 70 μL Schweinepankreas-α-Amylase (130 U/mL) und 40 μL Pilz-Amyloglucosidase (240 U/mL) eingeleitet. Die Reaktion wurde nach 30 Minuten durch 5-minütiges Erhitzen auf 95°C gestoppt. Die Mischung wurde sofort auf Eis abgekühlt und zentrifugiert (Thermo Scientific, Sorvall Legend Micro21, Deutschland). Der Überstand wurde aufgefangen und mit dem Megazyme-Glukose-Testkit auf Glukose untersucht. In Studien zur Intervention am Menschen wurde die Wirksamkeit einer AX-Konzentration von 0,25 bis 0,70 % festgestellt, weshalb wir diesen Konzentrationsbereich gewählt haben.

2.4. Inhibitionstest für die intestinale α-Glucosidase-Aktivität von Ratten

Die α-Glucosidase-Hemmungsmethode von Oki et al. wurde mit Modifikationen verwendet. Kurz gesagt wurde Ratten-Darm-Acetonpulver (500 mg) mit 10 ml Natriumphosphatpuffer (pH 6,9, 0,1 M) gemischt und im Eisbad 30 Sekunden lang (12 Mal) mit 15 Sekunden Pause beschallt, um einen Hitzestau zu verhindern. Anschließend wurde das Gemisch 10 Minuten lang bei 4°C und 10000 Umdrehungen zentrifugiert. Der Überstand wurde aufgefangen und mit Ratten-Darm-α-Glucosidase markiert. WEAX-Proben (40 mg) wurden in 2 mL Natriumphosphatpuffer (pH 6,9, 0,1 M) aufgelöst. Anschließend wurden 50 μL Ratten-Darm-α-Glucosidase mit 100 μL Probe oder Puffer (Kontrolle) gemischt und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Fünfzig μl 20 mM Saccharose oder 4 mM Maltose wurden hinzugefügt und 60 Minuten (Saccharose) bzw. 30 Minuten (Maltose) weiter inkubiert. Die endgültige Konzentration der WEAX-Fraktion betrug 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 und 0,0 % (w/v). Die Enzymaktivität wurde durch 10-minütiges Erhitzen auf 95°C gestoppt. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 10000 wurde der Überstand für die Glukoseanalyse mit dem Megazyme GOPOD-Glukose-Testkit gesammelt. Die prozentuale Hemmung der Alpha-Glucosidase (Sucrase oder Maltase) wurde berechnet als . Der IC50-Wert wurde aus dem Diagramm der prozentualen α-Glucosidase-Hemmung gegen die Probenkonzentration bestimmt. Die Hemmung der intestinalen α-Glucosidase der Ratte mit Acarbose (einem bekannten α-Glucosidase-Hemmer) wurde ebenfalls zu Vergleichszwecken durchgeführt. Anstelle der Probe wurden Acarbose-Konzentrationen von 1,625, 3,25, 4,9, 6,5, 9,8 und 13 μg/ml verwendet.

2,5. Statistische Analyse

Alle Analysen wurden in sechsfacher Ausführung durchgeführt (sofern nicht anders angegeben), und alle Statistiken wurden unter Verwendung der Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit der Statistiksoftware JMP 12 (SAS Institute Inc., Cary, NC) berechnet. Die Mittelwerte der Stichproben wurden mit der Tukey-HSD-Methode verglichen, und die signifikanten Unterschiede wurden bei . Korrelationen zwischen Parametern wurden mit dem Pearson-Korrelationstest berechnet.

3. Ergebnisse und Diskussion

Die Auswirkungen von WEAX auf die Stärkehydrolyse sind in Abbildung 1 dargestellt. Wir verglichen die Menge an Glukose, die während einer 30-minütigen Inkubation mit α-Amylase in Anwesenheit oder Abwesenheit von WEAX-Fraktionen freigesetzt wurde. Die Zugabe von WEAX-Fraktionen verringerte die produzierte Glukosemenge im Vergleich zur Kontrollbehandlung beträchtlich. Statistische Vergleiche zwischen den Behandlungsgruppen und der Kontrolle zeigten jedoch, dass der mittlere Unterschied für WA-f50, WA-f75 und WB-f75 unabhängig von der WEAX-Konzentration nicht signifikant war (). Die Anwesenheit von 0,5 % WB-f50 führte zu einer signifikanten Abnahme der Amylolyse im Vergleich zur Kontrolle (). Unsere Beobachtungen zur Alpha-Amylase-Aktivität stehen jedoch im Gegensatz zu anderen Berichten in der Literatur, was möglicherweise auf die Konzentration und den Typ von AX zurückzuführen ist. Die Amylolyse von Stärke wurde in Gegenwart von 1 und 2 % AX durchgeführt, und die verwendete AX enthielt keine Ferulasäure. Wir verwendeten AX-Konzentrationen (~5-10 g), die denjenigen entsprechen, die in Humanstudien zur Senkung des postprandialen Blutzuckerspiegels berichtet wurden.

Abbildung 1

Wirkung von mit Wasser extrahierbarem Arabinoxylan auf die Stärkehydrolyse.

Tabelle 2 zeigt die Wirkung von WEAX auf die α-Glucosidase-Aktivität in Gegenwart von Saccharose oder Maltose als Substrat. Die Daten sind als IC50 angegeben, d.h. die Konzentration des Inhibitors, die zu einer 50%igen Hemmung der α-Glucosidase-Aktivität führt. Die IC50-Werte reichten von 4,88-10,14 mg/ml gegen die α-Glucosidase-Aktivität mit Maltose als Substrat. Bei der Verwendung von Saccharose als Substrat wurde jedoch keine Hemmung beobachtet. Die hemmende Wirkung von WEAX gegen intestinale Maltase war im Vergleich zu Acarbose (einer Positivkontrolle) 1000-2000 Mal geringer. Es wird allgemein angenommen, dass die Viskosität die Ursache für die Wirkung von AX auf die postprandiale Glukose sein könnte. So fütterten Vogel et al. Ratten mit einer modifizierten AX aus Weizenkleie, um die Wirkung der Viskosität zu untersuchen. Auch die Hemmung der intestinalen Alpha-Glucosidase durch AX-Mono-/Oligosaccharide wurde mit deren Ferulasäure-Anteil in Verbindung gebracht. Daher wiesen WA-f50 und WB-f75 eine signifikant unterschiedliche Hemmkraft gegenüber der α-Glucosidase-Aktivität auf, obwohl sie ähnliche relative Anteile an unsubstituierten (un-Xylp), monosubstituierten (2-Xylp oder 3-Xylp) und disubstituierten Xyloseresten (2,3-Xylp) und einen ähnlichen Substitutionsgrad, aber einen unterschiedlichen Ferulasäuregehalt aufwiesen.

Das Verhältnis von Arabinose zu Xylose ist ein Maß für den Grad der Substitution (DS). Es wurde ein starker negativer linearer Zusammenhang ( = -0,67) zwischen DS und IC50 beobachtet. Dies könnte eine Folge der erhöhten Löslichkeit von AX aufgrund eines hohen DS sein. Somit scheint hoch substituiertes WEAX einen niedrigeren IC50-Wert zu haben (hohe Hemmwirkung). Die gleiche Beobachtung wurde durch den negativen Zusammenhang zwischen der Hemmwirkung und dem relativen Anteil an unsubstituierten Xyloseresten bestätigt. Das offensichtliche Verhältnis von Di-Xyl- zu Mono-Xyl-Resten schien keinen Einfluss zu haben, aber das Ausmaß der Xylose-Substitution zeigte eine Wirkung. Es ist daher wahrscheinlich, dass die Wirkung auf die α-Glucosidase-Aktivität von den Arabinoseresten von WEAX ausgeht. Es gibt Berichte über die Hemmung der α-Glucosidase-Aktivität durch Arabinose. Versuche, Arabinosereste aus WEAX mit Hilfe von Arabinofuranosidase zu entfernen, waren nicht erfolgreich, um die Hypothese zu beweisen. Wir stellten jedoch fest, dass das Mono-Xyl an C (O)-2 im Vergleich zum Mono-Xyl an C (O)-3 ein wichtiger Faktor war, was darauf hindeutet, dass die Hemmwirkung über das bloße Vorhandensein eines Arabinoserestes hinausgeht. Es bestand eine starke Korrelation zwischen Mono-Xyl bei C (O)-2 und dem Ferulasäuregehalt ( = 0,99). Daher ist es möglich, dass der beobachtete Einfluss von DS von dem der Ferulasäure abgeleitet wurde.

Das Lineweaver-Burk-Diagramm (Abbildung 2) wurde zur Berechnung der scheinbaren Maximalgeschwindigkeit () und der Michaelis-Menten-Konstante () für die α-Glucosidase-Aktivität auf Maltose in Gegenwart und Abwesenheit von WEAX verwendet. Die Wirkung der WEAX-Fraktion auf und wurde analysiert, um die Art der Hemmung zu bestimmen. und der α-Glucosidase für Maltose in Abwesenheit von WEAX-Fraktionen waren 17,5 μg Glucose pro Minute bzw. 5,99 mM. Tabelle 4 zeigt, dass die Zugabe von WEAX-Fraktionen beide Werte verringerte, was darauf hindeutet, dass WEAX die α-Glucosidase-Aktivität durch einen nichtkompetitiven Modus hemmt. Ein typisches Merkmal der nicht-kompetitiven Hemmung ist, dass sowohl und in Gegenwart des Inhibitors abnehmen. Daher ist es plausibel, dass WEAX-Fraktionen an den Enzymsubstratkomplex binden und dadurch sowohl und verringern. Es wurde auch festgestellt, dass Arabinose die α-Glucosidase-Aktivität durch einen nicht-kompetitiven Modus hemmt.

Abbildung 2

Lineweaver-Burk-Plot der Hemmung der intestinalen α-Glucosidase der Ratte durch wasserextrahierbares Arabinoxylan ().

Unsere Ergebnisse könnten eine Erklärung für die in der Literatur beobachtete Inkonsistenz bezüglich der Wirkung von AX auf den postprandialen Glukosespiegel liefern. Die Fütterung von diabetischen Zuker-Ratten mit AX (Ara/Xyl = 0,9) supplementiertem Brot führte zu einem signifikanten Rückgang des postprandialen Blutzuckerspiegels. Im Gegensatz dazu hatte die Aufnahme von nativem AX (Ara/Xyl = 0,5) keinen Einfluss auf die Blutzuckerreaktion. Auch die Ergänzung der Ernährung mit 6 und 12 g AX (Ara/Xyl = 0,66 oder 0,8) senkte den Blutzuckerspiegel sowohl bei gesunden als auch bei diabetischen Probanden. AX (Ara/Xyl = 0,8) dämpfte jedoch nicht die postprandiale Glukosereaktion bei gesunden erwachsenen Menschen. Bei Schweinen, die mit AX-haltigem Weißbrot gefüttert wurden, war der Netto-Glukosefluss im Vergleich zu Schweinen, die mit Weißbrot gefüttert wurden, reduziert. Das Fehlen einer detaillierten chemischen Zusammensetzung und Struktur erschwert den Vergleich der Ergebnisse zur Wirksamkeit von AX. Auch wenn die Konzentrationen der verwendeten AX gleich sind, hängt ihre Wirksamkeit von der Art der verwendeten AX ab. Wir haben gezeigt, dass AX, die bei einer Sättigung von 50 % Ammoniumsulfat gewonnen wurden, eine höhere Hemmwirkung aufweisen als AX, die bei 75 % gewonnen wurden.

4. Schlussfolgerung

Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die antiglykämische Wirkung von Arabinoxylanen möglicherweise auf die Hemmung der intestinalen α-Glucosidase-Aktivität, nicht aber der Amylase-Aktivität zurückzuführen ist. Die Wirksamkeit des wasserextrahierbaren AX auf die α-Glucosidase-Aktivität wurde durch den Ferulasäuregehalt, das Verhältnis von Arabinose zu Xylose und das Muster der Xylose-Substitution beeinflusst. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Hemmung der α-Glucosidase-Aktivität durch einen nicht-kompetitiven Mechanismus erfolgt. Somit kann der Verzehr von Nahrungsmitteln, die reich an wasserlöslicher AX sind, den postprandialen Blutzuckerspiegel senken.

Bekanntgabe

Ein Teil der Ergebnisse wurde als mündliches Poster auf dem Symposium Functional Foods and Natural Health Products Graduate Research (FFNHP)/Therapeutic Applications of Functional Foods and Bioactives (TAFFB) vorgestellt, das vom 20. bis 22. April 2016 im St-Boniface Hospital Albrechtsen Research Centre stattfand.

Interessenkonflikte

Alle erhaltenen Gelder oder materielle Unterstützung führten nicht zu Interessenkonflikten bei der Veröffentlichung dieses Manuskripts.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) über das Discovery Grant Programme finanziert. Die Autoren bedanken sich auch bei Cargill Limited für die Bereitstellung von Weizen-Aleuron-Proben und bei Ce Zhou, Alison Ser und Pat Kenyon vom Department of Food Science, University of Manitoba, für ihre technische Unterstützung.