Mai 12, 2018
Eine häufige Frage, die sich Wissenschaftler stellen, wenn sie das Signal eines antikörperbasierten Assays erhalten, ist: „Stellt dieses Signal wirklich das Vorhandensein und die Menge meines Proteins dar?“
Die Spezifität von Antikörpern ist für Wissenschaftler immer ein Problem. Obwohl es eine Reihe von Validierungsmethoden gibt, die für die Spezifitätsprüfung verwendet wurden, werden die Daten oft überinterpretiert. Forschungsdaten verschiedener Gruppen haben gezeigt, dass einige der auf dem Markt befindlichen monoklonalen Antikörper in Wirklichkeit nicht monospezifisch sind. Die Kreuzreaktivität kann Forscher mit falsch positiven Ergebnissen in die Irre führen und möglicherweise unerwartete Nebenwirkungen und falsche Diagnoseberichte für Kliniker verursachen.
Welche Kontrollen sollten wir also für die Validierung der Antikörperspezifität verwenden?
Zelllinien und Gewebe, die die Zielproteine in großen Mengen exprimieren, können als Positivkontrollen für die Antikörpervalidierung verwendet werden.
Es kann sich dabei um endogene Proteine oder überexprimierte Proteine handeln, die von einem cDNA-Klon kodiert werden. Eine Positivkontrolle ist jedoch nicht in der Lage, die Spezifität des Antikörpers zu bestätigen. Man kann zwar eine Bande in der richtigen Größe oder eine positive Färbung an der richtigen subzellulären Stelle sehen, aber es könnte sich dabei um falsch-positive Signale aufgrund der Kreuzreaktivität der Antikörper handeln. Daher ist für die Antikörpervalidierung normalerweise eine Negativkontrolle erforderlich, um die unspezifische Bindung zu beurteilen.
Die Knockout-Validierung ist bisher die beste Negativkontrolle für die Beurteilung der Antikörperspezifität. Bei der Knockout-Validierung wird der Antikörper an einer Knockout-Zelllinie getestet, die das Zielprotein nicht exprimiert. Seit 2017 hat sich OriGene mit EdiGene, einem CRISPR-Innovator, zusammengetan, um Doppel-Knockout-Zellen im Hochdurchsatzverfahren herzustellen. Im Gegensatz zu den Knockout-Zelllinien von Horizon stammen die OriGene-Knockout-Zellen von gängigen Zelllinien wie HEK293T oder HeLa, was das Produkt für Forscher relevanter macht.In dieser doppelten Knockout-Zelllinie ist das Antikörperziel nicht vorhanden, da das Gen, das für das Protein kodiert, eliminiert oder „ausgeknockt“ wurde. Proben von Knockout-Zellen und elterlichen Zellen (Wildtyp) werden nebeneinander gegen denselben Antikörper getestet. Wenn der Antikörper wirklich spezifisch ist, sollte er das spezifische Signal nur in Wildtyp-Zellen, nicht aber in der Knockout-Zelllinie nachweisen. Anhand der Lysate dieser Knockout-Zellen haben wir mehr als 100 monoklonale Antikörper validiert (KO-validierte Antikörper). Man geht davon aus, dass die Knockout-Validierung eine echte Negativkontrolle für die Prüfung der Antikörperspezifität darstellt.
Aber ist die Knockout-Validierung ausreichend, um die Monospezifität eines Antikörpers zu bestätigen? Zunächst einmal sind die Off-Target-Effekte von Knockout-Zellen derzeit noch nicht gut untersucht. So könnte eine Knockout-Zelle nicht nur die Expression des interessierenden Proteins eliminieren, sondern auch die Expression eines anderen Proteins, das mit dem Antikörper kreuzreagieren könnte, eliminieren oder reduzieren. Das negative Signal bedeutet also nicht immer, dass der Antikörper mit anderen Proteinen als dem interessierenden Protein reagiert. Zweitens ist das Testen mit Knockout-Zellen/Gewebe nur für die nicht-essentiellen Proteine möglich. Für die essenziellen Proteine ist ein Knockout unmöglich. Für diese Proteine benötigen Sie also eine andere Methode, um die Spezifität des Antikörpers zu testen.
Vor einigen Jahren entwickelte OriGene eine Proteinarray-Methode für Antikörperspezifitätstests. Mit der weltweit größten Sammlung von überexprimierten Lysaten haben wir einen einzigartigen Proteinchip hergestellt, der >10k überexprimierte menschliche Proteine in doppelter Ausführung auf einem einzigen mit Nitrocellulose beschichteten Glasträger enthält. Diese Proteinmicroarray-Technologie wurde zur Validierung der Spezifität vieler monoklonaler OriGeneUltraMAB™-Antikörper eingesetzt. Durch die Erhöhung der Proteinanzahl auf dem Chip kann die Kreuzreaktivität eines Antikörpers über das gesamte menschliche Proteasom weiter untersucht werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Prüfung der Antikörperspezifität ziemlich kompliziert ist. Da die Technologie weiter voranschreitet, werden wir über wertvollere Hilfsmittel und standardisierte Verfahren für die Antikörpervalidierung verfügen, so dass Wissenschaftler nicht mehr mit der gleichen Frage konfrontiert werden, wenn sie positive Signale von ihren antikörperbasierten Assays erhalten.