Asymmetrische Synthese von Batrachotoxin: Enantiomere Toxine zeigen funktionelle Divergenz gegen NaV

Die phänotypischen Wirkungen akuter Gifte, die in der reichhaltigen Pharmakopöe des terrestrischen und marinen Lebens zu finden sind, sind seit der Antike dokumentiert. Die Isolierung und Charakterisierung toxischer Verbindungen hat wichtige chemische Reagenzien für die Untersuchung komplexer biochemischer Kreisläufe verfügbar gemacht (1). Studien dieser Art haben eine große Anzahl von Peptiden und niedermolekularen Wirkstoffen ans Licht gebracht, die auf spannungsabhängige Natriumionenkanäle (NaVs) abzielen, eine obligatorische Klasse von Membranproteinen für bioelektrische Signalübertragung (1-4). Zu den bekannten NaV-Modulatoren gehören drei strukturell verwandte Wirkstoffe, (-)-Batrachotoxin, Veratridin und Aconitin (Abb. 1A) – sterisch große, lipophile Aminderivate, von denen man annimmt, dass sie einen gemeinsamen Bindungsort in der inneren Porenregion von NaV (3) haben (Stelle 2, Abb. 1B). Der Einfluss dieser Toxine auf das Ionen-Gating unterscheidet sich jedoch deutlich. Einerseits ist (-)-BTX, der primäre toxische Bestandteil von kolumbianischen Pfeilgiftfröschen (Gattung Phyllobates), ein vollständiger NaV-Agonist, der den Kanal bei hyperpolarisierten Membranpotentialen leichter öffnet und die schnelle Inaktivierung (neben anderen charakteristischen Effekten) blockiert (3-5). Im Gegensatz dazu lassen sich die Wirkungen von Veratridin und Aconitin am besten als partieller Agonismus bzw. als Hemmung der Kanalfunktion beschreiben (5). Trotz der jüngsten Erkenntnisse der Strukturbiologie über die dreidimensionale Architektur prokaryontischer NaVs (6-9) fehlt ein molekulares Verständnis des Einflusses der Site-2-Toxine auf die Ionenleitung und die Ionen-Gating-Kinetik. Studien zur Toxinstruktur und -aktivität können in Kombination mit Proteinmutagenese-Experimenten Fragen zur dynamischen Natur der Kanalfunktion klären und den rationalen Entwurf von niedermolekularen Modulatoren der NaV-Aktivität unterstützen (1). Die Potenz von (-)-BTX (10), seine lange Geschichte als archetypische niedermolekulare Site-2-Sonde (4) und seine unvergleichlichen Auswirkungen auf das Kanal-Gating machen es zu einer optimalen „Leitverbindung“ für solche Untersuchungen.

Die Bindung von (-)-BTX an NaVs verändert jeden Aspekt der Kanalfunktion, was zu einer hyperpolarisierten Verschiebung der Spannungsabhängigkeit der Aktivierung, einer Hemmung sowohl der schnellen als auch der langsamen Inaktivierung, einer Verringerung der Einzelkanalleitfähigkeit und einer Verringerung der Ionenselektivität führt (3, 4). Die Nützlichkeit dieses Naturprodukts als NaV-Aktivator hat zu einer erheblichen Verknappung der weltweiten Vorräte geführt, die einst mehr als 1 g betrugen, im Jahr 2009 jedoch weniger als 170 mg (11, 12). Seit das Toxin 1963 erstmals von Märki und Witkop aus Giftfröschen isoliert wurde, die im nördlichen Regenwald Kolumbiens gesammelt wurden (13), steht Phyllobates auf der Liste der gefährdeten Arten, so dass die Sammlung von natürlichem (-)-BTX aus dieser Quelle eingeschränkt ist. (-)-BTX wurde auch in ausgewählten Vogelarten (Gattung Pitohui und Ifrita) (14) und Käfern (Gattung Choresine) (15) nachgewiesen, allerdings nur in geringen Mengen (z. B. ~1,8 μg (-)-BTX pro Käfer). Obwohl Semi- (16) und Racemat-Synthesen (17) von BTX-A (Abb. 1C), einer Verbindung ohne den C-20-Pyrrolester, veröffentlicht wurden, schließt die Länge jeder dieser Arbeiten (>45 lineare Schritte) die einfache Herstellung von (-)-BTX oder ausgewählten Analoga aus. Dementsprechend hat unser Wunsch, BTX und modifizierte Formen davon für die Untersuchung der Kanaldynamik und der Ionen-Gating-Mechanismen zu verwenden, unsere Bemühungen motiviert, das Naturprodukt durch De-novo-Synthese zu erhalten.

Die retrosynthetische Analyse von (-)-BTX führte uns dazu, einen Plan zu skizzieren, der den späten Zusammenbau des Homomorpholin-E-Rings und die Ausarbeitung des C-20-Allylesters (Abb. 1C) ermöglichen würde, wodurch der Zugang zu modifizierten Formen des Toxins erleichtert würde. Frühere Studien zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung unter Verwendung einer kleinen Anzahl halbsynthetischer BTX-Derivate (10, 18) und C/D/E-Ring-BTX-Analoga (19) zeigten die Bedeutung des C-20-Esters, des tertiären Amins und des tetrazyklischen Gerüsts für die Aktivität des NaV-Agonisten. Die Entschlüsselung von BTX-A legt ein steroidähnliches Gerüst 1 frei, dessen Aufbau durch zwei winklige Gruppen an der C/D-Ring-Verbindung, das C-11-Exo-Methylen und das C-8/C-9-Alken, erschwert wird. Um die Konvergenz in unserem Syntheseplan zu maximieren, haben wir eine Trennungsstrategie für 1 über den C-Ring entwickelt. Diese Idee würde das Problem der Konstruktion von 1 in zwei Fragmente reduzieren, von denen eines das A/B-Ringsystem (3, 20) und das zweite das D-Ring-Cyclopentan (4, 21) darstellt. Bei erfolgreicher Durchführung dieses Schemas könnte das gewünschte Toxin durch eine Abfolge linearer Schritte von insgesamt nicht mehr als 20 bis 25 hergestellt werden.

Unsere Synthese von (-)-BTX begann mit der Kopplung von Methylencyclopentanon 4 (21) (Abb. S1A) und Vinylbromid 3, das durch eine modifizierte Abfolge von Schritten, die ursprünglich von Parsons und Mitarbeitern (20) beschrieben wurden, aus (S)-(+)-Hajos-Parrish-Keton gewonnen wurde (Abb. S1B). Die Verbindung der Fragmente 3 und 4 zum verknüpften A/B/D-Dreikreislauf 5 war die erste einer Reihe von Herausforderungen bei der Prozessentwicklung. Ein erster Versuch, diese Umwandlung durchzuführen, beinhaltete den Li-Br-Austausch von 3 mit n-BuLi (Bu, Butyl) und die sequentielle Zugabe von Enon 4. Obwohl unter diesen Bedingungen 5 geliefert wurde, lag die Produktausbeute nie über 30 %. Deuterium-Löschungsexperimente mit D2O bestätigten unsere Hypothese, dass die α-Deprotonierung von 4 mit dem gewünschten Keton-Additionsweg konkurriert. Transmetalisierungsreaktionen der Vinyl-Lithium-Spezies mit ZnCl2, ZnBr2, MgBr2-OEt2 (Et, Ethyl), CeCl3, Yb(OTf)3 (Tf, Trifluormethansulfonat), CeCl3-2LiCl und LaCl3-2LiCl wurden untersucht, aber keine dieser Maßnahmen erwies sich als effektiv (22, 23). Die Zugabe von einem Äquivalent wasserfreiem LiBr zum Reaktionsmedium von 3 verbesserte die Kopplungseffizienz um >20% (24). Mit einem optimierten Protokoll unter Verwendung von 2,1 Äquivalenten t-BuLi, das vermutlich ein Äquivalent LiBr in situ erzeugt, konnte 5 als einzelnes Diastereomer in 65 % Ausbeute im Multigramm-Maßstab reproduzierbar hergestellt werden. Die einfache Synthese dieses Materials und seiner desilylierten Form 6 ermöglichte es, die Bedingungen für die Tandem-Annulation des C-Rings und den Einbau des quaternären C-13-Zentrums zu ermitteln.

Eine Bewertung der verfügbaren Methoden für den Ringschluss von 1,6-Eninen führte uns dazu, radikalisch initiierte Prozesse in Betracht zu ziehen (25). Unter solchen Bedingungen könnte ein beginnendes C-13 3°-Radikal abgefangen werden, um die eckige Aminomethyleneinheit (oder ein geeignetes Surrogat) zu schmieden. Die Bemühungen, zunächst die Bildung des C-Rings an 6 zu untersuchen, zeigten jedoch, dass dieser Plan möglicherweise nicht aufgeht. Die Verwendung von n-Bu3SnH und Triethylboran (Et3B) zur Förderung der Cyclisierung führte zur Bildung von zwei Isomeren, 7 und 8, in einem Verhältnis von 1:5 zugunsten des unerwünschten Produkts (Abb. 2A). Studien von Stork und Beckwith und Mitarbeitern haben gezeigt, dass die Substratkonzentration und die Reaktionstemperatur die Art der Zyklisierung (d. h. 5-exo-trig versus 6-endo-trig) bei radikalvermittelten Enyne-Reaktionen beeinflussen können (26, 27). Bei erhöhter Temperatur (130°C) und fünffacher Verdünnung von 6 wurde eine Umkehrung der Selektivität beobachtet, die zu einem leichten Überschuss des gewünschten Tetrazyklusses führte (1,3:1 Verhältnis von 7 zu 8; Abb. 2A). Die kombinierte Produktausbeute dieser Umwandlung lag bei über 90 %, was trotz der bescheidenen Selektivitätsergebnisse zur weiteren Erforschung dieser Chemie ermutigt.

Wiederholte Versuche, das intermediäre C-13-Radikal mit Oxim- und Hydrazonderivaten aus Formaldehyd einzufangen, führten nicht zum erwarteten Aminomethylierungsprodukt (28). Wir sahen uns gezwungen, alternative Lösungen in Betracht zu ziehen und erkannten, dass eine modifizierte Silylethergruppe, die an den benachbarten C-14-Alkohol angehängt wurde, geeignet wäre, das 3°-Radikal abzufangen (29). Auf der Grundlage verfügbarer Präzedenzfälle wurde ein Alkinylsilylchlorid, Me3SiC≡CSiEt2Cl (Me, Methyl), für die Modifizierung des C-14-Alkohols in 6 ausgewählt (30, Abb. 2A). Die Behandlung des resultierenden Silylethers (9) mit n-Bu3SnH und Et3B bei 150°C führte zu einer Zyklisierungskaskade, die den Pentazyklus 10 als einziges Produkt ergab (31). Innerhalb der Grenzen der Protonen-Kernresonanz (1H NMR) wurde bei diesem Prozess keines der entsprechenden fünfgliedrigen C-Ring-Isomere erzeugt. Unsere vorläufigen Bemühungen, die Rolle der C-14-Substituentengruppen auf die Reaktionsselektivität zu verstehen, deuten darauf hin, dass der Silylschutz des Alkohols (zusammen mit den erhöhten Reaktionstemperaturen) den 6-endo-trig-Ringschluss begünstigt. Obwohl zusätzliche Studien erforderlich sind, um diese Strukturselektivitätsdaten zu bewerten, bietet unsere Enyne-Zyklisierungskaskade einen konvergenten Ansatz für die Synthese substituierter Steroidgerüste und sollte den Zugang zu einer breiten Palette solcher Verbindungen erleichtern.

Eine genaue Untersuchung der radikalischen Zyklisierungsprodukte, die entweder von 6 oder 9 abgeleitet sind, ergab ein unerwartetes Ergebnis, das die Struktur der resultierenden Organozinnan-Einheit betrifft (Abb. 2, A und B). Die Carbostannylierung der Alkin-Gruppe sollte ein Vinyl-Zinn-Produkt ergeben, wie es bei der Reaktion von 6 festgestellt wurde. Unerwarteterweise war das Allylstannan 10 das einzige Produkt, wenn 9 den Reaktionsbedingungen unterworfen wurde, ein Ergebnis, das sowohl durch NMR als auch durch Röntgenkristallographie bestätigt wurde. Die Bildung von Allylstannan 10 lässt sich durch einen Mechanismus erklären, bei dem ein 1,4-H-Atom auf ein intermediäres Vinylradikal (32) übertragen wird (Abb. 2B), ein Vorschlag, der durch ein Deuterium-Markierungsexperiment unterstützt wird (Abb. S5). Obwohl dieses Ergebnis nicht geplant war, zwangen uns die Effizienz und Selektivität der Cyclisierungsreaktion zu der Entscheidung, dieses Material weiterzuentwickeln. Die Vielseitigkeit der Allylstannan-Gruppe sollte bei künftigen Bemühungen um die Herstellung von C-Ring-modifizierten BTXen von Nutzen sein.

Die Verfügbarkeit von 10 in neun Schritten aus dem Hajos-Parrish-Keton ermöglichte die Herstellung erheblicher Mengen an Material zur Vervollständigung der Zielsynthese. Die Abspaltung des verbrückenden Silylethers in 10 wurde mit überschüssigem n-Bu4NF durchgeführt, wodurch ein Diol-Zwischenprodukt entstand, das anschließend durch 2-Iodoxybenzoesäure-vermittelte Alkoholoxidation und chemoselektive Vinylsilanspaltung zu 11 weiterentwickelt wurde (57 %; Abb. 2B). Die Umwandlung des Aldehyds 11 in das Chloracetamid 12 erfolgte in einer dreistufigen Einzelflaschen-Sequenz (16, 33). Die effiziente Schließung des Homomorpholinamidrings von 12 mit NaOEt (92 %) (17) lieferte ein vielseitiges Zwischenprodukt für die Modifizierung sowohl der C- als auch der D-Ring-Einheiten. Letzteres konnte durch das D-Ring-Enoltriflat erreicht werden, das mit KN(SiMe3)2 und PhNTf2 hergestellt wurde.

Die Einführung des C-11α-Alkohols aus dem C-Ring-Allylstannan 13 stellte eine der schwierigeren Herausforderungen in unserem Ansatz zu BTX dar (Abb. 2B). Obwohl die Protodestannylierung von 13 zur Erzeugung des entsprechenden C-11-Exo-Methylencyclohexans nur begrenzt erfolgreich war (34), führten alle nachfolgenden Versuche, diese Verbindung zum Keton 15 zu oxidieren (d. h. O3, OsO4 und RuO4), nicht zum Produkt. Angeregt durch einen Bericht von Kim und Fuchs versuchten wir, 13 mit Hilfe von CuCl2 in das entsprechende Allylchlorid umzuwandeln (35). Glücklicherweise lieferte die Durchführung dieser Reaktion in Dioxan unter aeroben Bedingungen Enal 14 in 85 % Ausbeute mit nur einer geringen Menge des chlorierten Produkts (~10 %). Obwohl die mechanistischen Details dieser Umwandlung unklar bleiben, ist uns nur ein weiteres dokumentiertes Beispiel einer solchen Oxidationsreaktion bekannt, bei der ein Vanadium-Katalysator und O2 verwendet werden (36). Enal 14 eignet sich für die Umwandlung in C-11-Keton 15 durch eine Reihe von Schritten zur Umwandlung funktioneller Gruppen, die durch eine Curtius-Umlagerung hervorgehoben werden (37). Das Fehlen eines lebensfähigen Chromophors am Batrachotoxinin A (BTX-A) erschwert die Reinigung dieses Materials; daher wurde in der Sequenz, die zu 15 führt, das C-3-Methoxyacetal durch p-Methoxyphenethylalkohol ausgetauscht.

Die Vervollständigung des Kohlenstoffgerüsts von (-)-BTX wurde durch eine Palladium-katalysierte Kreuzkupplung von Tributyl(1-ethoxyvinyl)zinn zu Vinyltriflat 15 (Abb. 3A) erreicht (38). Die In-situ-Hydrolyse des entstehenden Enolethers mit 1 M Oxalsäure lieferte Enon 16 (77 %). Nach einem umfangreichen Screening von Reduktionsmitteln gelang eine erfolgreiche stereoselektive globale Reduktion von Enon 16 in 33 % Ausbeute durch Behandlung mit frisch hergestelltem AlH3 (39). Wir vermuten, dass das Lewis-Basislactam (oder eine reduzierte Form) als zentrales stereokontrollierendes Element fungiert, da die Behandlung von Enon 15 mit alternativen Hydridreduktionsmitteln ausschließlich den unerwünschten C-11β-Alkohol lieferte. Die Verwendung von AlH3 begünstigte auch die Bildung des korrekten C-20-Allylalkoholepimers, ein stereochemisches Ergebnis, das durch ein Modell erklärt werden kann, das sich auf die Kontrolle der Chelatbildung beruft (38). Die Entschützung des Produkts aus der AlH3-Reduktion unter sauren Bedingungen lieferte (-)-BTX-A in 83 % Ausbeute (17). Schließlich wurde durch eine Modifikation des (-)-BTX-A-Acylierungsprotokolls von Tokuyama, Daly und Witkop mit dem gemischten Anhydrid aus Chlorameisensäureethylester und 2,4-Dimethylpyrrol-3-carbonsäure (10) die Synthese von 2 mg (-)-BTX (79 %, 0,25 % Gesamtausbeute) in 24 Schritten aus (S)-(+)-Hajos-Parish-Keton abgeschlossen. Das Produkt war in jeder Hinsicht identisch mit einer Probe des Naturstoffs und mit zuvor aufgezeichneten spektroskopischen Daten (40, 41). Unser Syntheseplan ermöglichte auch die Herstellung des unnatürlichen Toxin-Antipoden, (+)-BTX, des bekannten Benzoatesters von (-)-BTX-A (BTX-B; Abb. 3B) (42, 43) und des Enantiomers dieser Verbindung (ent-BTX-B) im Milligramm-Maßstab.

Die elektrophysiologische Charakterisierung von synthetischem (-)-BTX und BTX-B gegen NaV1.4 (rNaV1.4) der Ratte bestätigte, dass letzteres ebenfalls als Agonist wirkt und in seiner Potenz dem Naturprodukt ähnlich ist (Abb. S6 und Tabelle S12). Frühere Berichte und unsere eigenen Studien deuten darauf hin, dass die Estergruppe von BTX-B stabiler ist als das oxidationsempfindliche Acylpyrrol von BTX; daher wurden zusätzliche Experimente mit der ersteren Verbindung durchgeführt (42, 43). Synthetisches BTX-B wurde gegen eine Untergruppe von repräsentativen NaV-Isoformen getestet, darunter rNaV1.4, menschliches NaV1.5 und menschliches NaV1.7. Die Anwendung von 10 μM BTX-B auf Ovarialzellen des chinesischen Hamsters, die einen einzelnen NaV-Subtyp exprimieren, führte in allen Fällen zu einem anhaltenden Natriumstrom (Abb. 4A und Abb. S7 und S8). Der nutzungsabhängige Agonismus der NaV-Isoformen durch BTX-B verhinderte die Steady-State-Inaktivierung von >80 % der Natriumkanalpopulation (Abb. 4A und Abb. S8). BTX-B induzierte auch eine charakteristische hyperpolarisierende Verschiebung (-44,9 bis -51,5 mV) der halbmaximalen Spannung (V0,5) der Aktivierung von Wildtyp-NaV-Isoformen (Abb. 4B und Tabelle S13). Die Ähnlichkeit dieser Daten steht im Einklang mit der hohen Proteinsequenzkonservierung zwischen den NaV-Subtypen in den inneren, die Pore auskleidenden S6-Helices, die die mutmaßliche Toxin-Bindungsstelle bilden (Abb. S9).

In Anlehnung an frühere Arbeiten unseres Labors (19) und anderer (44, 45) fragten wir uns, ob die enantiomere Form von BTX mit hoher Affinität an NaV binden würde, mit analogen funktionellen Auswirkungen. Eine solche Frage kann nur beantwortet werden, wenn eine De-novo-Synthese des Toxins zur Verfügung steht. Daher wurden elektrophysiologische Ableitungen mit ent-BTX-B gegen rNaV1.4 durchgeführt. Diese Daten zeigten, dass ent-BTX-B ein gebrauchs- und zustandsabhängiger Kanalantagonist ist, mit einer gemessenen halbmaximalen Hemmkonzentration von 5,3 ± 0,6 μM. Die Konzentration für die halbmaximale Hemmung von NaV durch ent-BTX-B ist in der Größenordnung der halbmaximalen effektiven Konzentration für BTX-B-Agonismus (1,0 ± 0,1 μM; Abb. S10), die unter identischen Bedingungen gemessen wurde. Im Gegensatz zum natürlichen Antipoden verursachte die Bindung von ent-BTX-B nur eine minimale Verschiebung der V0,5 der Aktivierung und der V0,5 der Inaktivierung im stationären Zustand (Tabelle S14). Darüber hinaus war die Kanalblockade durch diesen Inhibitor vollständig reversibel.

Um festzustellen, ob BTX-B und ent-BTX-B eine überlappende Bindungsstelle in der inneren Porenregion von NaV besitzen, wurde ent-BTX-B an fünf rNaV1.4-Einzelpunktmutanten getestet, von denen bereits gezeigt wurde, dass sie die BTX-Bindung destabilisieren (Abb. 4, E und F, und Abb. S12) (19). Die Mutation von N434 (46), L1280 (47), F1579 (48) und N1584 (48) zu Lysin führte zu einer ~3- bis 30-fachen Abnahme der Stromblockade durch 5 μM ent-BTX-B. Gegen F1236K (49) behielt ent-BTX-B jedoch eine signifikante Aktivität (33,6 ± 2,1 % Stromhemmung). Der offensichtliche Unterschied zwischen ent-BTX-B und BTX-B deutet auf eine überlappende, aber nicht identische Bindungsregion innerhalb der inneren Porenhöhle hin. Es scheint, dass der offene Kanal ausreichend groß ist, um lipophile tertiäre Aminliganden aufzunehmen (19, 45, 50). Geringfügige Veränderungen in der Bindungsposition dieser Liganden scheinen die funktionelle Reaktion des Proteins drastisch zu verändern. Zukünftige Untersuchungen werden darauf abzielen, die genauen Kanal-Toxin-Wechselwirkungen zu beschreiben, die die Aktivierung von der Hemmung durch BTX-Derivate und verwandte lipophile Toxine unterscheiden.