Bakterizide Aktivität von Grüntee-Extrakten: die Bedeutung von catechinhaltigen Nanopartikeln

Bioaktivitätstests – Anti-Streptokokken-Aktivität

Die drei verschiedenen Grüntees und ihre Extrakte und Partikel, die bei 5000 U/min, 10000 U/min und 20000 U/min gewonnen wurden, wurden auf ihre antibakteriellen Eigenschaften gegen den Zahnerreger S. mutans untersucht. Um die Konzentration des Grüntee-Extrakts für weitere Experimente zu optimieren, wurden sechs verschiedene Konzentrationen (0 μL, 50 μL, 100 μL, 200 μL, 300 μL und 500 μL) von GT-0 (ohne Entfernung von Partikeln) und 5K-S aus GT 1, GT 2 und GT 3 gegen S. mutans getestet. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse dieser Studie. Wie aus Abb. 2(a) ersichtlich, zeigte die spektrophotometrische Methode, dass die Anti-Streptokokken-Aktivität von GT-0 und 5K-S im Vergleich zu allen drei Grüntees mit zunehmender Konzentration anstieg. Es wurde festgestellt, dass eine Konzentration von 300 μl eine optimale antimikrobielle Aktivität aufweist und daher als optimierte Konzentration für alle anderen Versuche in dieser Studie festgelegt wurde. Daher wurden von nun an alle Experimente mit 300 μl Konzentrationen der Grüntee-Variablen durchgeführt. Abbildung 2(b) zeigt die Ergebnisse der antimikrobiellen Bewertung unter Verwendung der Gesamtkeimzahlmethode. Die Ergebnisse der Keimzahlbestimmung korrelieren mit den Ergebnissen der Trübungsmessungen mit dem Spektralphotometer. Eine weitere interessante Beobachtung aus diesen Ergebnissen ist die marginale Verbesserung der antimikrobiellen Aktivität, die bei der Entfernung der Partikel bei 5000 U/min (5K-S) im Vergleich zu GT-0 beobachtet wurde. Im Vergleich zu GT 1-0 zeigte GT 1-5K-S eine erhöhte antibakterielle Aktivität, ähnlich wie bei GT 2 und GT 3. Außerdem wurde beobachtet, dass GT 3 die höchste antibakterielle Aktivität und GT 1 die geringste antibakterielle Aktivität aufwies.

Da die Entfernung der Partikel aus dem Grüntee Veränderungen in der Bioaktivität des Grüntee-Extrakts zeigte, wurde vorgeschlagen, eine detaillierte Untersuchung dieses Effekts durchzuführen. Es wurde ein systematischer dreistufiger Zentrifugationsprozess bei 5000 U/min, 10.000 U/min und 20.000 U/min durchgeführt, um die größten, kleineren und noch kleineren Partikel aus dem Extrakt zu trennen. Der von den großen Partikeln (5K-S), den kleinen Partikeln (10K-S) und den feinen Partikeln (20K-S) befreite Extrakt und die Partikel (5K-P, 10K-P und 20K-P) wurden auf ihre Wechselwirkung mit S. mutans und ihre individuellen antibakteriellen Aktivitäten untersucht. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse dieser Studie. Wie in Abb. 3(a-1,a-2) zu sehen ist, bestätigten sowohl die auf der Trübung basierende Methode als auch die Methode der Plattenzählung, dass die Entfernung von 5K-P im Vergleich zu GT 1 zu einer (geringfügigen) Steigerung der antibakteriellen Aktivität des Extrakts (5K-S) im Vergleich zu GT 1-0 führte. Die Entfernung von 10K-P führte zu keiner weiteren Verstärkung, und 10K-S wies in der Regel eine ähnliche Aktivität wie 5K-S auf. Die Entfernung von 20K-P führte jedoch zu einem deutlichen Verlust der antimikrobiellen Aktivität von 20K-S. Diese Beobachtung war bei GT 2 (Abb. 3(b-1,b-2)) und GT 3 (Abb. 3(c-1,c-2)) deutlich zu beobachten. Obwohl der Trend von GT 1 über GT 2 bis GT 3 unterschiedlich stark ausgeprägt war, bleibt die Tatsache unbestritten, dass die Entfernung der großen Grünteepartikel aus dem Extrakt die antibakterielle Eigenschaft des Grüntee-Extraktes geringfügig erhöhte und dass die Ausmerzung der kleineren Grünteepartikel-Fraktionen aus dem Extrakt zu einer deutlichen Abnahme der antibakteriellen Aktivität des Grüntees führte.

Es ist jedoch wichtig, an dieser Stelle zu betonen, dass weder die 5K-P-, 10K-P- noch die 20K-P-Partikel eine höhere alleinige antibakterielle Aktivität als die Extrakte zeigten. Die 5K-P Partikel zeigten keine antibakterielle Aktivität, 10K-P zeigte ein begrenztes Ausmaß an antibakterieller Aktivität, während die 20K-P eine gewisse Aktivität inmitten der anderen beiden Gegenstücke zeigten.

Echtzeittests von Zahnbakterien

Um diese Variation in der Bioaktivität der Grüntee-Extrakte, die von den Grüntee-Partikeln befreit wurden, in Echtzeitsystemen zu bewerten, wurden die Extrakte gegen reale Proben des Zahnbiofilms von fünf verschiedenen menschlichen Freiwilligen eingesetzt. Getestet wurden GT 0, 5K-S und 20K-S von GT 1, GT 2 und GT 3. Abbildung 4 zeigt die Gesamtzahl der lebensfähigen Keime nach der Plattenzählmethode und gibt an, welche Bakterien die Interaktion mit dem grünen Tee überlebt haben. Interessant war die Beobachtung, dass trotz der Komplexität der Probe 5K-S im Vergleich zu GT 0 eine erhöhte antibakterielle Aktivität zeigte, während 20K-S im Vergleich zu allen drei Grüntees eine geringere antibakterielle Aktivität aufwies.

Die Fluoreszenzdarstellung der Zellen mit Acridinorange hilft bei der Visualisierung und Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen nach der Behandlung. Wir haben die dentalen Biofilmproben der fünf Probanden vor und nach der Interaktion mit GT 0, 5K-S und 20K-S sowie der Kontrolle abgebildet. Abbildung 5 zeigt die Fluoreszenzergebnisse, die die Wirkung der Grüntee-Variablen auf Proband 1 (A), Proband 2 (B), Proband 3 (C), Proband 4 (D) und Proband 5 (E) zeigen. Wie in Abb. 5(a) zu sehen ist, zeigen die Kontrollbilder in A, B, C, D und E überwiegend orangefarbene Fluoreszenz, was auf das Vorhandensein von aktiv metabolisierenden lebenden Zahnbakterien hinweist. Wie auf dem Bild zu sehen ist, behielt der von den Zähnen abgelöste Biofilm seine Biofilm-Identität bei und erscheint im Falle der Kontrolle als mikrobielle Matte. Die GT 0-Behandlung führte bei allen Probanden zu der erwarteten abtötenden Wirkung von grünem Tee (Abb. 5(b)). Die grün fluoreszierenden Bereiche (tote Zellen) überwogen, daneben gab es Bereiche mit oranger Fluoreszenz. Tafel (c) zeigt die Ergebnisse des 5K-S-Überstandes von GT 3, bei dem die größten Grünteepartikel aus dem Extrakt entfernt wurden. Wie auf den fluoreszenzmikroskopischen Bildern zu sehen ist, wurde keine orangefarbene Fluoreszenz beobachtet, sondern eine vollständige grüne Fluoreszenz, was auf eine vollständige Vernichtung der Zahnbakterien/des Biofilms hinweist. Interessant war auch die Beobachtung, dass keine Biofilmflecken oder -matten mehr zu sehen waren, die Biofilmmatten waren aufgelöst und alles, was man sieht, sind verstreute Zellklumpen in allen Testproben (A(c), B(c).C(c).D(c) und E(c). Abb. 5(d) schließlich zeigt die Ergebnisse der 20K-S-Interaktion, wobei ein deutlicher Rückgang der abtötenden Wirkung des Grüntee-Extrakts zu erkennen ist. Das Auftreten der orange fluoreszierenden lebenden Bakterienzellen deutet auf eine Abnahme der antimikrobiellen Aktivität des Extrakts bei Entfernung der Nanobestandteile des grünen Tees hin. Obwohl auch grün fluoreszierende tote Zellen beobachtet wurden, schien das Verhältnis zwischen lebenden und toten Zellen verändert zu sein. Diese Ergebnisse bestätigten den Trend, der durch die spektrophotometrische Methode und die Plattenzählmethode der antimikrobiellen Aktivität der verschiedenen Testkomponenten des grünen Tees berichtet wurde.

FE-SEM-Beobachtung der Kontrolle und der mit 5K-S interagierenden Zahnbakterien ist in Abb. 6 (a-c) dargestellt. Wie aus der Abbildung ersichtlich, zeigt die Kontrolle (Abb. 6(a)) einen gut entwickelten Biofilm (Volunteer 4), während die Interaktion von GT 0 (Abb. 6(b)) von GT 3 und 5K-S (Abb. 6(c)) zu einer Schädigung der Zellen und des Biofilms führte, wie die Zelltrümmer zeigen. Die mit CLSM aufgenommenen Bilder (d) zeigen, dass eine große Mehrheit der Zahnbakterien aller fünf Probanden durch GT 3 (5K-S) abgetötet wurde. GT 3-GT 0 und 5K-S erwiesen sich als die vielversprechendsten Mittel gegen die Zahnbakterien aller Probanden.

Charakterisierung des Extrakts und der Partikel

Da die Ergebnisse der Bioaktivitätstests auf der Grundlage der antibakteriellen Aktivität der Grünteekomponenten zeigen, dass die An- und Abwesenheit der Grünteepartikel die Aktivität des Extrakts tatsächlich verändert, ist es notwendig, die Extrakte GT 0, 5K-S, 10K-S und 20K-S und anschließend die Partikel 5K-P, 10K-P und 20K-P der drei Grüntees ausführlich zu charakterisieren.

Biochemische Charakterisierung

Die antibakterielle Aktivität wird im Allgemeinen durch die Gesamtphenole, die Flavanoide und die antioxidative Fähigkeit eines Extrakts bestimmt. Alle diese Parameter wurden untersucht und mit den in dieser Studie verwendeten Extrakten und Partikeln verglichen. Abbildung 7(a) zeigt die Ergebnisse im Fall von GT 1. Bei den Flavanoiden wurde, wie aus dem Diagramm ersichtlich, kein großer Unterschied im Flavanoidgehalt zwischen den Extrakten GT 0, 5K-S, 10K-S und 20K-S festgestellt, wobei GT 0 im Vergleich zu den übrigen Extrakten einen marginalen Anstieg zu zeigen schien. Bei den Grünteepartikeln wies 5K-P den höchsten Flavanoidgehalt auf, 10K-P und 20K-P folgten mit ähnlichen Flavanoidgehalten wie in den Extrakten. Bei GT 2 (Abb. 7(b)) und GT 3 (Abb. 7(c)) war der Flavanoidgehalt unterschiedlich, wobei die Extrakte 5K-S und 10K-S im Vergleich zu GT 0 die höchsten Flavanoidgehalte aufwiesen. Die Partikel 5K-P und 10K-P zeigten sehr niedrige Flavanoidgehalte. Die Ausnahmen waren, dass die 20K-S Extrakte im Vergleich zu den anderen Extrakten weniger Flavanoide aufwiesen und die 20K-P Partikel im Vergleich zu den anderen Partikeln höhere Flavanoide aufwiesen.

In Bezug auf die Gesamtphenole wurde in GT 1 der höchste Wert in GT 0 gefunden, während die übrigen Komponenten geringere Werte aufwiesen. Bei GT 2 und GT 3 wurde jedoch wiederum ein ähnlicher Trend beim Phenolgehalt beobachtet, bei dem alle Extrakte nahezu ähnliche Phenolgehalte aufwiesen. Aber 5K-P und 10K-P wiesen im Vergleich zu 20K-P den geringsten Phenolgehalt auf.

In Bezug auf die antioxidative Aktivität zeigten die Extrakte der GT 1 (GT 0, 5K-S, 10K-S und 20K-S) eine sehr hohe antioxidative Aktivität, während 5K-P und 10K-P eine sechsmal geringere antioxidative Aktivität aufwiesen. Allerdings muss hier erwähnt werden, dass die 20K-P’s im Vergleich zu den 5K-P und 10K-P eine deutlich höhere antioxidative Aktivität aufwiesen. Bei GT 2 und GT 3 war dieser Trend noch ausgeprägter, wobei 5K-S und 10K-S im Vergleich zu GT 0 eine höhere antioxidative Aktivität aufwiesen. Bei 20K-S wurde jedoch ein deutlicher Rückgang der antioxidativen Aktivität beobachtet, während die Aktivität bei 20K-P von GT 2 und GT 3 entsprechend zunahm. Es ist anzumerken, dass unter den drei untersuchten Grüntees GT 3 höhere Werte dieser bioaktiven Verbindungen aufwies, dicht gefolgt von GT 2 und schließlich deutlich abgeschlagen GT 1. Dieser Trend korreliert stark mit der antimikrobiellen Bioaktivität der Grüntees, die in der Reihenfolge GT 3 > GT 2 > GT 1 lag.

FE-SEM-Analyse

Die 5K-P, 10K-P und 20K-P Partikel wurden mittels FE-SEM auf ihre morphologischen Details und Größen abgebildet. Abbildung 8 zeigt die 5K-P (a), 10K-P (b) und 20K-P (c) Morphologie der Partikel von GT 1 (A), GT 2 (B) und GT 3 (C). In den meisten Fällen wurden unregelmäßige Morphologien ohne ausgeprägte Form beobachtet. Wie aus Abb. 8 hervorgeht, sind die 5K-P-Partikel im Falle von GT 1 und GT 2 makroskopisch groß, d. h. sie sind in unserer Tasse Grüntee sichtbar. Tabelle 1 zeigt ihre Größen, GT 2 (B) 5K-P Partikel waren die größten (50-80 μm), gefolgt von GT 1 (B(a)), die im Größenbereich von 15-25 μm lagen. GT 3 5K-P-Partikel waren relativ kleiner im Bereich von 6-30 μm (Abb. 8(C(a)). Wie in den mikroskopischen Aufnahmen zu sehen ist, wiesen die Partikel keine festen Größen auf, was bei derartigen rohen, nicht standardisierten kommerziellen Proben zu erwarten ist. Die 10K-P-Partikel lagen im Falle von GT 1 (A(b)) im Mikrobereich von 4-10 μm, GT 2 lag bei 2-10 μm (Abb. 8B(b)) und GT 3 im Größenbereich von 0,5-3 μm (C(b)). Die 20K-P-Teilchen waren kleiner, mikro- bis nanoskalig, wobei GT 1-Teilchen im Bereich von 0,5-6 μm (A(c)), GT 2-Teilchen (B(c)) im Bereich von 200 nm bis 540 nm und GT 3-Teilchen (C(c)) im Größenbereich von 50 nm-300 nm lagen. Wie diese Ergebnisse zeigen, wurden 20K-P-Partikel, die verbesserte bioaktive Komponenten besaßen und antioxidative und antibakterielle Eigenschaften aufwiesen, im Nah-Nano-Bereich beobachtet.

UV-Vis-Spektrophotometrie

Abbildung 9 zeigt das UV-Vis-Spektrum der Extrakte und Partikel, die auf ihren EGCG-Gehalt untersucht wurden. Atomssa & Gotlap 201539 haben die Absorption für die Catechin-Familie angegeben: EGCG zeigt eine Absorption im Bereich von 248-361 nm in Wasser mit λmax bei 273,6 nm; ECG 246- 363 nm λmax bei 276,8 nm; der Spektralbereich von EGC in Wasser ist 254-378 nm und λmax bei 269,6 nm und der von EC ist 252-328 nm mit λmax bei 278,4 nm. Wie in Abb. 9(a) GT-1 zu sehen ist, sehen wir nur den EGCG-Absorptionspeak bei 273 nm. In Bezug auf den EGCG-Peak wurde kein Unterschied zwischen den Extrakten (GT 0, 5K-S, 10K-S und 20K-S) festgestellt. Bei den Grünteepartikeln wurde jedoch festgestellt, dass die EGCG-Intensität bei den 20K-P-Partikeln im Vergleich zu den 5K-P- und 10K-P-Partikeln deutlich anstieg. Es war interessant zu beobachten, dass die 20K-P’s fast 50% EGCG in den Extrakten enthielten.

Im Fall von GT 2 wurde beobachtet, dass die Extrakte das Vorhandensein anderer Peaks der Catechinfamilie im Bereich von 248-363 nm aufwiesen, wie aus den verschiedenen Peakspitzen in diesem Bereich in Abb. 9(b) ersichtlich ist. Die Entfernung der Partikel aus dem Extrakt führte zu Verschiebungen in den Peaks. Insbesondere die Extrakte zeigten deutliche Verschiebungen. Bei den Partikeln 5K-P und 10K-P wurde jedoch beobachtet, dass sie nur EGCG-Peaks und in geringer Intensität aufwiesen. Der Schwerpunkt liegt hier auf den 20K-P-Partikeln, die im Vergleich zu den Extrakten fast ähnlich intensive Catechin-Peaks aufwiesen. Es wurde beobachtet, dass die 20K-P im Gegensatz zu den 5K-P und 10K-P nicht nur EGCG-Peaks, sondern auch die anderen Peaks der Catechin-Familie zeigten, die den Extrakten ziemlich ähnlich sind.

GT 3 (Abb. 9(c)), die Extrakte ergaben verschiedene Peaks, einschließlich der Catechin-Peaks. Im Vergleich zu GT 1 und GT 2 zeigten die 5K-P- und 10K-P-Partikel jedoch selbst EGCG-Peaks von hoher Intensität. Der Trend, dass die 5K-P- und 10K-P-Partikel nur EGCG-Peaks aufwiesen, hielt auch in GT 3 an. Das 5K-P wies im Vergleich zu seinen GT-1- und GT-2-Pendants eine höhere EGCG-Intensität auf, aber im Vergleich zu den 10K-P von GT 3 war sie viel geringer. Die 10K-P von GT 3 wiesen ähnliche EGCG-Gehalte auf wie die Extrakte. Die 20K-P’s wiesen in diesem Fall die höchsten Catechin-Peaks auf und übertrafen auch die Extrakte. Bei den 20K-P’s gegenüber den Extrakten wurden ähnliche Peakverschiebungen wie bei der Wasser- und Lösungsmittelextraktion beobachtet. Interessant war, dass die 20K-P-Peaks schmaler und von hoher Intensität waren. Ein außergewöhnlich hoher Peak bei 269 nm, der dem EGC entspricht, wurde in den 20K-P’s beobachtet. Die allgemeine Beobachtung, dass die 20K-P’s signifikant große Mengen an Catechinen in GT-1, GT 2 und GT 3 enthielten, wurde durch diese Studien bestätigt.

FT-IR

Das FT-IR-Spektrum, das von den Partikeln 5K-P, 10K-P und 20K-P von GT 3 erhalten wurde, die die höchste antibakterielle Aktivität und einzigartige Eigenschaften zeigten, ist in Abb. 10(a) dargestellt. Die Spektren stimmen mit der charakteristischen Bande von EGCG überein. Ponnuraj et al, 201540 berichten über EGCG-Fingerabdrücke bei 3357,46 cm-1 für die O-H-Gruppe, die an den aromatischen Ring gebunden ist, 1691,27 cm-1 und 1616,06 cm-1 stark für die C = O-Gruppe, die die Trihydroxybenzoatgruppe und die Chroman-Gruppe verbindet, 1447,31 cm-1 für die C-H-Gruppe, die im Chroman-Ring vorhanden ist, 1348.00 cm-1, 1222.65 cm-1 für die O-C = O Gruppe, 1148.40 cm-1 für die O-H Gruppe, 1041.37 cm-1 für die C-O-C Gruppe, die den Chromanring und den Trihydroxybenzoatring verbindet und 825.38 cm-1 für die C-H Gruppe im aromatischen Ring. Interessant und unterstützend war die Beobachtung, dass mit zunehmender Zentrifugation ein deutliches Muster zu beobachten war, das mit abnehmender Partikelgröße korrespondiert. Bei 5K-P war die Intensität der EGCG-Banden am geringsten, gefolgt von 10K-P und 20K-P mit hoher Intensität. Dies stimmt mit den Ergebnissen überein, die auch in den UV-Studien beobachtet wurden.

Abbildung 10(b) zeigt die FT-IR-Spektren von GT 1 5K-P und 20K-P. Im Fall von GT 1 gab es keinen großen Unterschied in den EGCG-Banden zwischen den beiden Partikeln. Diese Ergebnisse stimmen mit denen überein, die auch bei den UV-spektrophotometrischen Untersuchungen beobachtet wurden. Abbildung 10(c) zeigt die vergleichenden Spektren der 20K-P von GT 1, GT 2 und GT 3. Das Gradientenmuster der erhöhten EGCG-Banden in der Reihenfolge GT 1 < GT 2 < GT 3 ist offensichtlich.