134.1 Xanthophyllomyces dendrorhous Golubev (1995)
Anamorph: Phaffia rhodozyma M.W. Miller, Yoneyama & Soneda (1976b)
Wachstum auf Hefemorphologie-Agar: Nach 1 Monat bei 18°C ist die Streifenkultur orange bis lachsrot, fast glatt, glänzend bis halbmatt, weich und mit ganzem oder gewelltem Rand. Es können sich kugelförmige Chlamydosporen mit refraktilen Körnchen bilden.
Wachstum in Glucose-Hefeextrakt-Peptonwasser: Nach 3 Tagen bei 18°C sind die Zellen kugelig bis eiförmig, 3-10×5-13 μm, mit kleinen Kapseln. Die Zellen treten einzeln, paarweise oder gelegentlich in kurzen Ketten auf (Abb. 134.2). Eine dünne, kriechende Pellicula kann vorhanden sein. Nach 1 Monat können Sediment, ein Ring und manchmal Inselchen vorhanden sein.
Schiebekulturen auf Maismehl-Agar: Nach 10 Tagen bei 18°C können rudimentäre Pseudohyphen auftreten. Es werden keine echten Hyphen gebildet. Ballistoconidien werden nicht beobachtet.
Bildung von Basidiosporen: Basidiosporen können nach 2-3 Wochen bei 18°C auf Agarmedien beobachtet werden, die Polyole (Ribitol, d-Glucitol, l-Arabitol oder d-Xylitol) und Pentosen (d-Ribose, d-Xylose oder d-Arabinose) enthalten. Nach der Konjugation zwischen einer Zelle und ihrer Knospe bildet sich ein schlankes zylindrisches Holobasidium mit einem Durchmesser von 2-3 μm und einer Länge von 30-165 μm (normalerweise 70-80 μm) (Abb. 134.3). Selten kommt es zur Konjugation zwischen unabhängigen Zellen oder zur Bildung eines Basidiums ohne offensichtliche Konjugation. Gewöhnlich werden drei bis vier (bis zu sechs) dünnwandige ovale oder ellipsoidische Sporen von 3-6×5-12 μm an der terminalen Spitze des Basidiums gebildet. Die Basidiosporen befinden sich auf kurzen Basidiophoren und keimen durch Knospung. Ballistosporen werden nicht gebildet.
Fermentation
Glucose | ws |
Galaktose | – |
Sucrose | +/ws |
Maltose | -/ws |
Lactose | – |
Raffinose | w/- |
Trehalose | w |
Wachstum (in flüssigen Medien)
Glucose | + |
Inulin | w/- |
Sucrose | +/-1 |
Raffinose | +/s |
Melibiose | – |
Galaktose | – |
Laktose | – |
Trehalose | + |
Maltose | + |
Melezitose | + |
Methyl-α-d-Glucosid | w/- |
Lösliche Stärke | + |
Cellobiose | + |
Salicin | v |
l-Sorbose | -/w |
l-Rhamnose | – |
d-Xylose | +/s |
l-Arabinose | + |
d-Arabinose | – |
d-Ribose | w/- |
Methanol | – |
Ethanol | s/+ |
Glycerin | s/w |
Erythrit | – |
Ribitol | w/- |
Galactitol | – |
d-Mannitol | +/-1 |
d-Glucitol | -/s |
myo-Inositol | – |
dl-Lactat | v |
Succinat | +/s |
Citrat | +/-1 |
d-Gluconat | +/s |
d-Glucosamin | – |
N-Acetyl-d-Glucosamin | – |
Hexadecan | – |
Nitrat | – |
Vitamin-frei | – |
1 CBS 9090 zeigte negative Reaktionen auf diese Verbindungen.
Zusätzliche Wachstumstests und andere Merkmale
Xylitol | w/- |
2-Keto-d-gluconat | + |
5-Keto-d-Gluconat | w |
d-Glucuronat | v |
Arbutin | + |
l-Arabinitol | w/- |
d-Glucono-1,5,-Lacton | v |
d-Galacturonat | v |
Butan-2.3, Diol | – |
Propan 1,2-Diol | w/- |
d-Glucarat | w/- |
d-Galactonat | w/- |
Nitrit | – |
Lysin | +/w |
Cadaverin | +/-1 |
Kreatin | – |
Glucosamin | – |
Imidazol | – |
d-Tryptophan | +/w |
10% NaCl/5% Glucose | – |
50% Glucose mittel | w |
Stärkebildung | + |
DBB | + |
Gelatineverflüssigung | w |
Wachstum bei 25°C | + |
Wachstum bei 30°C | – |
1 CBS 9090 zeigte negative Reaktionen auf diese Verbindung.
CoQ: 10 (Sugiyama et al. 1985).
Mol% G+C: 48,3 (BD: Miller et al. 1976b).
Zell-Kohlenhydrate: Mannose, Xylose, Glucose, Galactose und Rhamnose sind in Ganzzellhydrolysaten vorhanden (Johnson et al. 1978).
Typstamm: CBS 7918.
Herkunft der untersuchten Stämme: Die in der obigen Standardbeschreibung angegebenen Daten wurden aus dem Typstamm CBS 7918 zusammengestellt, der von Golubev (1995) aus dem Fluss einer Silberbirke (Betula pendula) in der Moskauer Region Russlands isoliert wurde, sowie aus der CBS-Website für die Stämme CBS 5905, der der Typstamm von Phaffia rhodozyma ist und aus einer japanischen Buche (Fagus crenata) in Japan isoliert wurde (Phaff et al. 1972); CBS 5908, isoliert aus einer japanischen Erle (Alnus japonica) in Japan (Phaff et al. 1972); CBS 6938, isoliert aus einem Stumpf von Betula sp. in Finnland, gesammelt von O. Turpeinen in Finnland im Mai 1977 (Golubev 1998b); CBS 7919, isoliert aus einer Weißbirke (Betula tauschii) in Japan (Phaff et al. 1972) und CBS 9090, der vermutlich aus derselben Quelle wie CBS 5905 stammt (Fell et al. 2007). Diese Stämme und weitere Isolate wurden anhand phylogenetischer Analysen untersucht (Fell et al. 2007, siehe unten: „Systematik“).
Systematik: Xanthophyllomyces ist ein Mitglied der Cystofilobasidiales. Xanthophyllomyces hat einen ausgeprägten sexuellen Fortpflanzungszyklus unter den Cystofilobasidiales und unter den Basidiomyceten im Allgemeinen. Der Zyklus ist homokaryotisch durch die Paarung von Zelle und Knospe. Es entsteht ein längliches Holobasidium, und die Basidiosporen werden endständig an winzigen Zapfen gebildet. Die endständige Bildung von Basidiosporen an Holometabasidien ist bei den Cystofilobasidiales zu beobachten (siehe Cystofilobasidium capitatum). Im Gegensatz dazu beinhaltet der Sexualzyklus bei C. capitatum und anderen Mitgliedern der Cystofilobasidiales die Bildung von Teliosporen, ein Merkmal, das bei Xanthophyllomyces nicht vorhanden ist.
Ökologie: Xanthophyllomyces dendrorhous wurde aus dem Saft von Bäumen in gemäßigten Regionen der nördlichen und südlichen Hemisphäre isoliert. Zu den Habitaten gehören die japanische Erle (Alnus japonica) in Japan (Phaff et al. 1972), ein verrottender Stumpf einer Birke (Betula sp.) in Finnland (Golubev 1998b), Papierbirke (Betula papyrifera) in Alaska, Weißbirke (B. tauschii) in Japan (Phaff et al. 1972), Graubirke (B. populifolia) in Wisconsin und Illinois, USA (gewonnen von C.P. Kurtzman, wie in Fell et al. 2007 berichtet), Weißbirke (B. pendula) in Russland (Golubev 1995) und verrottende Stümpfe in Kaiserslautern, Deutschland (Weber et al. 2006), Hartriegel (Cornus brachypoda) in Japan (Phaff et al. 1972), Japanische Buche (Fagus crenata) in Japan (Phaff et al. 1972) und die Südbuche (Nothofagus sp.) in Argentinien (Libkind et al. 2007). In der letztgenannten Studie wurde über das Vorkommen von X. dendrorhous in Verbindung mit Fruchtkörpern des Ascomyceten Cyttaria hariotti berichtet, der ein Parasit der Südbuche ist. Kürzlich wurde von Weber et al. (2008) ein Xanthophyllomyces-Stamm (MIC-CONC-2006-762) aus einem Blatt des tasmanischen Blaugummibaums (Eucalyptus globules) im mediterranen Klima von Concepción, Chile, isoliert. Die Autoren berichteten, dass der Stamm in phylogenetischen Analysen von ITS und LSU rRNA nicht mit dem X. dendrorhous-Komplex (einschließlich Phaffia rhodozyma) geclustert wurde. Der Stamm unterscheidet sich von anderen Xanthophyllomyces-Stämmen auch durch die Fähigkeit, bei 28 °C zu wachsen, im Gegensatz zur typischen Höchsttemperatur für das Wachstum von 25 °C. Der blaue Eukalyptus ist in Tasmanien und Australien beheimatet und wurde wegen seines Wertes für die Holzproduktion in die ganze Welt exportiert. Eine Untersuchung der Xanthophyllomyces-Stämme, die mit der weltweiten Verbreitung des Blaugummibaums in Verbindung stehen, könnte interessante ökologische und phylogenetische Informationen liefern.
Biotechnologie: Xanthophyllomyces dendrorhous hat einen Wert in der Biotechnologie als Quelle von Astaxanthin, hauptsächlich für die Marikultur (Johnson und Schroeder 1995). Die ersten Studien mit Salmoniden und Tierfutter, die die Wirksamkeit als Pigmentierungsquelle zeigten, wurden mit Phaffia rhodozyma durchgeführt (siehe Kapitel 152). In der Folge wurden Stämme von X. dendrorhous, die hohe Mengen an Astaxanthin produzieren, für die kommerzielle Produktion entwickelt. Die meisten Mutanten wurden durch zufällige Mutagenese und Screening isoliert, da keine Kenntnisse über die Genetik der Art vorhanden waren. Es wurden Methoden für die Isolierung von Mutanten mit hoher Produktion entwickelt, wie z.B. die Antimycin-Agar-Selektion, die Anwendung von Durchflusszytometrie und Zellsortierung (An et al. 1989, 1991) und Bedingungen für eine erhöhte Carotinoidsynthese während des Wachstums (Gu et al. 1997, Schroeder und Johnson 1995, Schroeder et al. 1996).
Da die Carotinoid-Biosynthese eines der herausragenden Merkmale von X. dendrorhous ist, wurde sie eingehend untersucht. Etwa 85% sind Astaxanthin mit geringen Mengen an β-Carotin und anderen Carotinoiden (Andrewes et al. 1976). Astaxanthin aus P. rhodozyma, und vermutlich auch in X. dendrorhous, hat die 3R, 3R‘-Konfiguration, die der von Astaxanthin aus anderen bisher untersuchten Quellen entgegengesetzt ist (Andrewes und Starr 1976). Carotinoidgehalt und -menge variieren erheblich, was vom Stamm und den Kulturbedingungen abhängt. Die Carotinoidproduktion wird durch Sauerstoff und abgeleitete reaktive Sauerstoffspezies deutlich stimuliert (An et al. 1989, Johnson und Lewis 1979, Schroeder et al. 1985). Es wurden viele Carotinoid-bildende Mutanten isoliert, die auf Agar verschiedene Farben des Wachstums aufweisen, darunter weiß, gelb und tief orange-rot (Johnson 2003). Die Bildung von Carotinoiden und die attraktive Hefefarbe sind ein hervorragendes Lehrmittel in der Hefebiologie (Weber und Davoli 2003).
Die Biosynthese der verschiedenen Carotinoide in X. dendrorhous und P. rhodozyma ist kaum verstanden. Es wurden Gene isoliert und sequenziert, die zu β-Carotin führen (Visser et al. 2003). Im Jahr 1989 wurde vorgeschlagen, dass Cytochrom P-450-Enzyme für die Umwandlung von β-Carotin in Astaxanthin verantwortlich sind (An et al. 1989), und erst 2006 wurde ein Gen isoliert, das für ein Cytochrom P-450 der menschlichen 3A-Unterfamilie kodiert, das vermutlich für die Umwandlung von β-Carotin verantwortlich ist. Die Einführung des Gens in eine von An et al. (1989) isolierte β-Carotin-Mutante stellte die Astaxanthin-Biosynthese wieder her (Ojima et al. 2006). Der vollständige Nachweis, dass dieses Genprodukt allein für die Umwandlung von β-Carotin in Astaxanthin verantwortlich ist, erfordert jedoch weitere Studien, einschließlich der Reinigung und Charakterisierung des Enzyms/der Enzyme. Bislang ist die Analyse der Enzyme für die Carotinoid-Biosynthese noch nicht abgeschlossen, was in erster Linie auf ihre lipophile Natur und die Lage an der Membran, den Mangel an kommerziell verfügbaren Carotinoid-Substraten im Biosyntheseweg und die Wahrscheinlichkeit einer langsamen katalytischen Aktivität zurückzuführen ist.
In anderen Studien wurde berichtet, dass X. dendrorhous ein Trisaccharid, Neokestose, mit potenzieller probiotischer Aktivität produziert (Kritzinger et al. 2003). Kürzlich wurde aus X. dendrorhous eine α-Glucosidase mit amylolytischer Aktivität isoliert (Marín et al. 2006), was die Fähigkeit der Hefe, auf Maltose zu wachsen, untermauert.
Der primäre Lebensraum von X. dendrorhous und P. rhodozyma wird in den Schleimflüssen von Laubbäumen in nördlichen Breiten und Höhenlagen gesehen. In diesem Habitat besteht die Funktion der Carotinoide in der Hefe wahrscheinlich darin, Schutz gegen durch Licht erzeugte antimykotische Substanzen im Baumfluss wie reaktive Sauerstoffspezies einschließlich Singulett-Sauerstoff, Wasserstoffperoxid und Ozon zu bieten (Schroeder und Johnson 1995). Lichteinwirkung beeinflusst auch das Wachstum und die Bildung von Carotinoiden bei X. dendrorhous (An und Johnson 1990). Schroeder und Johnson (1993a,b, 1995) wiesen nach, dass eine primäre physiologische Funktion der Carotinoide in X. dendrorhous darin besteht, vor der Abtötung durch reaktive Sauerstoffspezies zu schützen. X. dendrorhous wird häufig aus Schleimflüssen oder Laubbäumen oder in Verbindung mit anderen Pilzen isoliert, und es ist anzunehmen, dass es zwischen den Pilzen zu Wechselwirkungen kommt. Echavarri-Erasun und Johnson (2004) stellten fest, dass Wachstum und Astaxanthinbildung von X. dendrorhous durch den Ascomyceten Epicoccum nigrum und zellfreie Extrakte des Pilzes beeinflusst wurden. Ein Beispiel für die Interaktion mit Pilzen ist die Tatsache, dass X. dendrorhous-Stämme unter Laborbedingungen Ochratoxin abbauen (Péteri et al. 2007), ein Toxin, das von Aspergillus- und Penicillium-Arten produziert wird. Weitere Untersuchungen der Ökologie von X. dendrorhous und der Interaktionen innerhalb mikrobieller Konsortien würden zu einem besseren Verständnis der Biologie der Hefe führen.
Landwirtschaft und Lebensmittel: Astaxanthin wird kommerziell als Futterzusatz hergestellt, hauptsächlich für die Aquakultur von Salmoniden. Das Pigment könnte schließlich auch auf anderen Futtermittelmärkten für Geflügelfleisch, Hühnereier, Krustentiere und exotische Vögel wie Flamingos Verwendung finden. Astaxanthin ist ein feiner chemischer Stoff, der traditionell durch chemische Totalsynthese hergestellt wird. Der Prozess erfordert jedoch mehrere Schritte und führt zu einer Mischung aus vier chiralen Isoformen (Johnson und Schroeder 1995). Die natürlichen Formen von Astaxanthin bestehen nur aus einer chiralen Isoform, entweder 3S, 3S‘- oder 3R, 3R‘. Zu den natürlichen Quellen, die für die Verwendung in Futter- und Lebensmitteln erforscht wurden, gehören die Hefe X. dendrorhous, die Mikroalge Haematococcus pluvialis, Thraustochytriden und Extrakte aus Krill und Garnelen, aber Extrakte aus Krill und Krustentieren sind aufgrund ihrer geringen Konzentrationen an Astaxanthin wirtschaftlich nicht verwertbar.
Nach der Identifizierung von Astaxanthin in Phaffia rhodozyma durch Andrewes et al. (1976) begannen einige amerikanische, dänische, niederländische, schweizerische und japanische Unternehmen mit der Entwicklung von Stämmen für die industrielle Nutzung. In der Industrie wurden Stämme von X. dendrorhous entwickelt, die 5-15 mg/kg Hefetrockenmasse produzieren. Haematococcus pluvialis ist ebenfalls eine kommerzielle natürliche Quelle für Astaxanthin, und unter speziellen Kulturbedingungen produziert die Alge große Mengen Astaxanthin (10-20 mg/g) in den Zysten. Die Kultur der Alge erfordert spezielle und langwierige Kulturbedingungen und die Freisetzung von Astaxanthin aus den Zysten. X. dendrorhous hat den Vorteil eines schnellen Wachstums und einer hohen Biomasse in der Fermentationskultur (100-150 g Hefe pro Liter). Die Hefe muss jedoch bei niedrigen Temperaturen (≤25°C) gezüchtet werden, und als zusätzliches Problem für die Verwendung als Futtermittelzusatzstoff muss die dicke Zellwand der Hefe durch mechanischen Bruch, enzymatischen Verdau oder Autolyse bearbeitet werden, um die Freisetzung der Carotinoide zu ermöglichen.
Klinische Bedeutung: Die Hefe wächst nicht über 25°C und gilt als sicher für den menschlichen Verzehr. Astaxanthin hat starke antioxidative Eigenschaften und wird als Nahrungsergänzungsmittel vermarktet, das degenerativen Krankheiten und der Alterung vorbeugen könnte (Hussein et al. 2006).