Nicht-organoide Ansätze
Bislang waren Darmepithelzelllinien die wichtigsten In-vitro-Modellsysteme zur Bewertung von Transportprozessen im Darm, während enteroendokrine Zelllinien übliche Modelle zur Untersuchung der Sekretion verschiedener Darmhormone sind. Ein etabliertes Modell für Dünndarm-Enterozyten ist die CaCo-2-Zelllinie (oder der CaCo-2 TC7-Subklon), die von einem Kolonadenokarzinom stammt. Diese Zelllinie wird üblicherweise auf Transwell-Platten bis zu 3 oder 4 Wochen nach der Befruchtung für Studien zum intestinalen Transport von Nährstoffen, Medikamenten oder anderen Verbindungen unter Verwendung von radio- oder fluoreszenzmarkierten Substraten gezüchtet (Farrell et al., 2013; Ganapathy et al., 1995; Wang und Li, 2017). Bei den HT-29-Zellen (und Subklonen) handelt es sich um eine menschliche Kolonkarzinom-Zelllinie, die für die Erforschung von Darmtransportern, insbesondere Zuckertransportern, gut geeignet ist (Delezay et al., 1995; Liu et al., 2016). Um die Rolle von Transportern bei der intestinalen Nährstofferkennung zu untersuchen, werden jedoch andere Zelllinien benötigt. Die bekanntesten enteroendokrinen Zelllinien, die für Studien zur Hormonsekretion im Darm verwendet werden, sind die murine GLUTag-Zelllinie (Emery et al., 2015), die murine STC-1-Zelllinie (Jiang et al., 2016) und die menschliche NCI-H716-Zelllinie (Pais et al., 2014). Keine von ihnen spiegelt jedoch die komplexe Biologie der enteroendokrinen Zellen in vivo wider (Kuhre et al., 2016). Enteroendokrine Zellen sind über den gesamten Dünn- und Dickdarm verteilt, und ihre Expressionsmuster verschiedener Darmhormone unterscheiden sich stark, je nach ihrer Lage im Darmtrakt (Habib et al., 2012). So nimmt beispielsweise die Zahl der GLP-1-sezernierenden Zellen (oft als L-Zellen bezeichnet) vom proximalen zum distalen Darm allmählich zu, während die Zahl der GIP-sezernierenden Zellen (als K-Zellen bezeichnet) abnimmt. Somit stellen enteroendokrine Zelllinien, die alle aus Tumoren stammen, sehr einfache und künstliche Modellsysteme für die Untersuchung der Nährstoffsensierung, der Hormonsekretion im Darm und der zugrunde liegenden molekularen und regulatorischen Mechanismen dar. Der Vorteil von Säugetierzelllinien ist, dass sie in zahlreichen Labors auf der ganzen Welt gut etabliert sind. Es liegen viele wissenschaftliche Daten und etablierte Versuchsprotokolle vor. Außerdem sind sie einfach zu handhaben und ihre Kultivierung ist kostengünstig. Dennoch handelt es sich bei all diesen Zelllinien um sehr einfache und künstliche Modellsysteme. Sie stammen meist aus Tumoren und repräsentieren nur einen einzigen Zelltyp, der nicht die Komplexität der Darmschleimhaut widerspiegelt, die mehrere spezialisierte Zelltypen umfasst. Außerdem werden sie in der Regel zweidimensional gezüchtet, was die dreidimensionale Architektur des natürlichen Darms nicht widerspiegelt.
Insbesondere für Studien zur Nährstoffsensierung und Hormonsekretion im Darm sind primäre Darmzellkulturen ein weitaus besserer Ansatz und haben sich in den vergangenen Jahren als zuverlässiges Modell etabliert (Reimann et al., 2008). Primärkulturen, die aus isolierten Darmkrypten gezüchtet werden, haben den Vorteil, dass sie aus verschiedenen Darmsegmenten (Parker et al., 2012), aus Mäusen (Wildtyp oder Knockout-Tiere) (Diakogiannaki et al., 2013) oder aus Menschen (Habib et al., 2013) gewonnen werden können. Sie umfassen absorbierende Enterozyten sowie verschiedene Subtypen enteroendokriner Zellen, wie sie im natürlichen Darm vorkommen. Diese Kulturen enthalten jedoch wenig differenzierte Enterozyten und eignen sich daher nicht für den Nachweis von intestinalen Transportern und Rezeptoren auf Protein- oder Funktionsebene. Sie sind ein Kurzzeit-Kultursystem, das sich nicht für Langzeitexperimente eignet, und können nicht passagiert werden, wodurch sich die Zahl der für die Kulturvorbereitung benötigten Versuchstiere erhöht. Das Gleiche gilt für isolierte Darmepithelzellen (Grossmann et al., 1998), die alle Schleimhautzelltypen umfassen, aber in vitro nur eine sehr begrenzte Lebensfähigkeit aufweisen und kein intaktes Epithel darstellen.
Die Kurzzeitstabilität ist auch eine Einschränkung für Gewebeexplantate wie umgedrehte Darmringe (Roder et al, 2014) oder Darmsäcke aus dem Darm von Mäusen oder Ratten (Praslickova et al., 2012; Surampalli et al., 2016), die häufig für Transportstudien verwendet werden. Evertierte Darmringe können entweder mit markierten Substraten in vitro inkubiert oder nach oraler Verabreichung von z. B. radioaktiv markierten Transportersubstraten in Nagetieren hergestellt werden (Roder et al., 2014). Evertierte Darmsäcke können sogar für Fluxstudien verwendet werden, da die luminalen und basolateralen Kompartimente getrennt anvisiert werden können. Die Präparation und Handhabung ist jedoch nicht trivial und erfordert eine gewisse Erfahrung. Der Vorteil von Gewebeexplantaten besteht darin, dass sie aus verschiedenen Darmsegmenten hergestellt werden können und ihre regionalspezifischen In-vivo-Eigenschaften in vitro erhalten bleiben. Das Darmexplantat behält seine ursprüngliche Architektur bei, und die Schleimhaut ist mit dem sie umgebenden Gewebe wie der Submukosa oder der Muskulatur verbunden, und Neuronen, Lymphe und Blutgefäße sind ebenfalls enthalten. Je nach wissenschaftlicher Fragestellung kann dies ein Vorteil oder ein Nachteil sein. Die intestinale Wahrnehmung von Nährstoffen und die anschließende Sekretion von Darmhormonen wird manchmal im perfundierten Nagerdarm untersucht (Kuhre et al., 2015). Das Tier wird betäubt und das Darmlumen wird ex vivo mit den vermeintlichen Stimulanzien perfundiert. Die basolaterale Flüssigkeit wird gesammelt, und der Inhalt der Darmhormone wird analysiert. Diese Technik ist technisch nicht einfach, und ethische Hürden schränken die breite Anwendung dieser Methode für Studien zur nährstoffinduzierten Hormonfreisetzung im Darm ein.
Ein zuverlässiges und gut etabliertes Modell für Studien zu den funktionellen Eigenschaften und der Regulierung von Darmtransportern ist die heterologe Expression in Xenopus laevis-Oozyten (Hirsch et al., 1996). Nach der Injektion von mRNA wird das betreffende Protein im Oozyten exprimiert, und die Transportkinetik kann mithilfe von radioaktiv markierten Substraten oder elektrophysiologischen Ansätzen im Falle von elektrogenen Transportern untersucht werden (Schulze et al., 2014; Stelzl et al., 2016). Diese Technik ist ein hervorragendes Instrument zur Untersuchung der funktionellen Eigenschaften eines bestimmten Transporters, obwohl sich das Zielprotein in einer künstlichen Umgebung befindet und keine regulatorischen Faktoren vorhanden sind, wie es in der Säugetierzelle der Fall wäre. Darüber hinaus sind die Verfügbarkeit intakter Eizellen und die komplizierte Handhabung, einschließlich der Injektion der Eizellen, kritische Punkte, die bei der Anwendung dieser Technik berücksichtigt werden müssen. Wesentlich einfacher sind heterologe Expressionssysteme wie Hefe und E. coli. Sie ermöglichen die Erzeugung rekombinanter Mutanten, die, sobald sie erzeugt sind, in größerem Maßstab kultiviert oder fermentiert werden können und große Mengen an Protein liefern. Obwohl diese Mikroorganismen billig und leicht zu handhaben sind, stellen sie sehr vereinfachte Modellsysteme für die Untersuchung von Säugetierproteinen und insbesondere von großen Membranproteinen dar. Probleme, die häufig auftreten, sind die Fehlfaltung des Proteins oder der fehlgeschlagene Einbau in die Membran. Daher sind diese Systeme eher für die strukturelle Charakterisierung von gereinigten Proteinen oder Proteindomänen geeignet (Beale et al., 2015) als für detaillierte Studien zur Funktion und Regulierung von Säugetiertransportern.
Neue und vielversprechende Ansätze, die in der jüngsten Vergangenheit etabliert wurden, sind dreidimensionale Säugetierzellkulturmodelle. Intestinale Zelllinien wie CaCo-2 oder HT-29 werden auf Gerüsten gezüchtet, wodurch eine eher darmähnliche Architektur entsteht, die zu einer besseren Differenzierung führt (Chen et al., 2015). Andere dreidimensionale Modelle werden direkt aus menschlichen Dünndarmepithelzellen und Myofibroblasten auf beschichteten mikroporösen Membranen gezüchtet (Maschmeyer et al., 2015a; Maschmeyer et al., 2015b) und können nicht in vitro vermehrt werden. Diese Modelle haben das Potenzial, für Transportstudien von Nährstoffen oder Medikamenten eingesetzt zu werden, und aus menschlichen Darmepithelzellen gezüchtete Kulturen umfassen sogar verschiedene Schleimhautzelltypen, jedoch keine enteroendokrinen Zellen. Das Gleiche gilt für dreidimensionale bioprinted Gewebe, eine andere Technologie, die erst vor kurzem entstanden ist und große Aufmerksamkeit erregt hat. Dieser Ansatz ist für die regenerative Medizin und die Transplantation von größerem Wert als für die experimentelle Forschung (Murphy und Atala, 2014). Das Bioprinting von verschiedenen Geweben, darunter Herz, Haut und Knochen, hat sich erfolgreich etabliert, aber bioprinted Darmgewebe sind bisher selten und müssen weiter verbessert werden (Wengerter et al., 2016).