In unserer Studie, haben wir retrospektiv das Vorhandensein von CALR-Mutationen in einer Kohorte von 524 JAK2 V617F-negativen Patienten nachgewiesen, die sich mit klinischem und/oder Laborverdacht auf MPN vorstellten, mit dem Hauptziel, den diagnostischen Wert dieses Nachweises zu bestimmen. Während des Beobachtungszeitraums wurden CALR-Mutationen bei Patienten mit Verdacht auf MPN in unserem Zentrum nicht routinemäßig untersucht, da sie erst vor kurzem entdeckt worden waren1,2. Im Gegensatz dazu wurde die JAK2 V617F-Mutation seit ihrer Entdeckung im Jahr 2005 bereits routinemäßig analysiert20. Daher wurden JAK2 V617F-positive Patienten von der Studie ausgeschlossen. Eine MPL-Mutation ist ein relativ seltener Befund bei MPN-Patienten und findet sich meist bei Patienten mit ET oder PMF21. In unserem Labor wurde der MPL-Test erst kürzlich in den diagnostischen Algorithmus bei Patienten mit Verdacht auf MPN aufgenommen und wird erst nach Ausschluss von JAK2 V617F und CALR-Mutationen durchgeführt. Daher wurde der MPL-Status nicht bei allen unseren Patienten zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung bestimmt.
Unser Zentrum ist ein medizinisches Universitätskrankenhaus, das ein Gebiet mit etwa 1.000.000 Einwohnern versorgt und ein Überweisungszentrum für hämatologische Malignome ist. Alle Patienten, die an die hämatologische Abteilung überwiesen wurden, wurden zunächst von Allgemeinärzten ohne detaillierte Kenntnisse auf dem Gebiet der hämatologischen Malignome untersucht. Wie in Tabelle 3 dargestellt, wies nur ein Teil der an die hämatologische Abteilung überwiesenen Patienten zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung pathologische klinische und/oder Laborparameter auf, die auf eine MPN hinwiesen. Daher handelte es sich bei den meisten Patienten, die an die Abteilung für Hämatologie überwiesen wurden, um Personen ohne ein hämatologisches Malignom, da wir feststellten, dass 380 Patienten (380/524 = 72,5 %) frei von MPN waren. Bei diesen Patienten wurden sekundäre Veränderungen des peripheren Blutgehalts diagnostiziert, die auf verschiedene Ursachen zurückzuführen waren, wie Eisenmangel, Infektions- und Entzündungskrankheiten, Hyposplenismus, bösartige Erkrankungen, Rauchen, kürzlich durchgeführte Operationen, Verwendung von Kortikosteroiden und chronische Hypoxie. Dementsprechend war die Zahl der CALR-positiven Patienten in unserer Kohorte gering. Wir identifizierten 4,4 % der Patienten mit MPN-Verdacht als CALR-positiv, wobei bei den meisten von ihnen entweder ET oder PMF diagnostiziert wurde. In den meisten ähnlichen Studien wurde die Zahl der CALR-positiven Patienten mit bestätigter MPN analysiert; daher war die Zahl der CALR-positiven Patienten viel höher und lag zwischen 12 und mehr als 20 %22,23,24,25,26. Auf der Grundlage unserer Daten wäre es von Vorteil, die Diagnostik bei Patienten mit erhöhten Spiegeln einer oder mehrerer Blutzelllinien zu verbessern, da dies in den meisten Fällen nicht durch ein hämatologisches Malignom verursacht wird. Die Patienten sollten routinemäßig auf die häufigsten Ursachen einer sekundären Erythrozytose, Thrombozytose und Leukozytose untersucht werden, und das Blutbild sollte mindestens einmal bei Nachuntersuchungen wiederholt werden, bevor eine Überweisung an die Abteilung für Hämatologie erfolgt. Molekulargenetische Tests sollten Patienten mit starkem Verdacht auf eine klonale hämatologische Erkrankung vorbehalten bleiben und nicht bei allen Patienten durchgeführt werden, die an die Abteilung für Hämatologie überwiesen werden.
CALR-Mutationen werden häufig bei JAK2 V617F-negativen Patienten mit ET1,2 festgestellt. In unserem Zentrum wurde nur bei einer Minderheit der CALR-positiven Patienten (7/23 = 30%) zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung eine ET nach den WHO-Kriterien von 2008 diagnostiziert. Der Hauptgrund dafür war die relative Zurückhaltung gegenüber einer Knochenmarkuntersuchung bei Patienten mit mäßiger Thrombozytose und einem geringen Risiko für thrombotische Komplikationen. Dies bedeutet jedoch, dass wir die Zahl der Patienten mit klonaler Thrombozytose unterschätzt haben könnten. Durch die Bestätigung des Vorliegens von CALR-Mutationen konnten wir retrospektiv 9 Patienten mit ET gemäß den modifizierten WHO-Kriterien für ET13 diagnostizieren. Obwohl alle diese Patienten aufgrund des hohen Verdachts auf klonale Thrombozytose in unserer Abteilung weiterbehandelt wurden, ist es von großem prognostischen und therapeutischen Nutzen, die Diagnose ET durch ein nicht-invasives Verfahren wie einen molekulargenetischen Test bestätigen zu können. CALR-Mutationen sind daher ein wichtiges diagnostisches Merkmal für ET, wie kürzlich auch in der Literatur bestätigt wurde27,28.
Alle Patienten mit PMF wurden zum Zeitpunkt der Untersuchung in der Abteilung für Hämatologie nach den WHO-Kriterien diagnostiziert. Die Identifizierung der CALR-Mutation bestätigte retrospektiv die Diagnose, hatte jedoch keine direkte diagnostische oder therapeutische Auswirkung.
CMML ist ein Subtyp von MDS/MPNs und nicht streng genommen MPNs12. CALR-Mutationen bei Patienten mit CMML sind extrem selten und spielen keine wichtige Rolle in der Pathogenese. Eine Gruppenstudie von Zamora et al. zeigte, dass nur einer von 174 Patienten mit CMML eine CALR-Mutation aufwies29. Der Patient in unserer Studie, bei dem eine CMML Typ 1 diagnostiziert wurde und der später eine Myelofibrose entwickelte, könnte bei der ersten Untersuchung falsch diagnostiziert worden sein, da PMF und CMML viele gemeinsame Merkmale aufweisen, darunter Monozytose und Knochenmarkfibrose. In einer neueren Studie von Hu et al. konnten durch eine genauere Analyse viele Patienten, bei denen CMML diagnostiziert worden war, als PMF reklassifiziert werden, was zeigt, dass eine gründlichere Analyse durchgeführt werden sollte, um eine genaue Diagnose zu stellen, insbesondere bei Patienten mit molekularen Biomarkern, die typisch für ET/PMF sind11,30.
Mehr als 50 CALR-Mutationen mit Frameshift sind beschrieben worden, und alle befinden sich im Exon 9 des CALR-Gens. Es gibt zwei Haupttypen von CALR-Mutationen: Typ 1 (eine 52-bp-Deletion; p.L367fs*46) und Typ 2 (eine 5-bp TTGTC-Insertion; p.K385fs*47). Auf der Grundlage ihrer molekularen Merkmale können andere Mutationen als Typ 1-ähnlich und Typ 2-ähnlich eingeteilt werden31. In unserer Studie war der häufigste Typ der CALR-Mutation Typ 1, was mit den Daten aus der Literatur übereinstimmt2,16,32. Mutationen, die weder dem Typ 1 noch dem Typ 2 angehören, sollten als Typ-1-ähnlich oder Typ-2-ähnlich klassifiziert werden, da dies Auswirkungen auf den klinischen Phänotyp und – im Falle der PMF – sogar auf das Überleben haben kann17. Typ-1-ähnliche und Typ-2-ähnliche Mutationen wurden in unserer Studie mit Hilfe von AGADIR15 definiert, einem statistischen Näherungsalgorithmus, der die Helixneigung für die 31 einzigartigen Aminosäuresequenzen berechnet, die durch CALR-Mutationen verändert werden16. Dieser Algorithmus wurde bereits in ähnlichen Studien verwendet und stellt ein wichtiges Instrument für die Subklassifizierung von CALR-Mutationen dar16,17. Es scheint äußerst wichtig zu sein, den Typ der CALR-Mutation richtig zu definieren, da dies auch diagnostische Auswirkungen hat. Es ist bekannt, dass nur Mutationen, die zu einem + 1 (-1 + 2) Frameshift des Leserasters führen, pathogen sind6. Andere CALR-Mutationen können Keimbahnvarianten von CALR sein, deren klinische Bedeutung unbekannt ist. In unserer Studie wurden bei zwei Patienten CALR-Mutationen ohne Frameshift nachgewiesen. Bei einem dieser Patienten wurde zum Zeitpunkt der Untersuchung in der Abteilung für Hämatologie eine reaktive Thrombozytose diagnostiziert und er wurde retrospektiv als CALR-positiv definiert. Eine detaillierte Analyse bestätigte eine CALR-Missense-Mutation, die zu einer Substitution von Glutaminsäure durch Asparaginsäure an der Aminosäureposition 398 führt. Die gleiche Mutation wurde in einer Studie von Lasho et al. bei einem Patienten mit einer von der WHO definierten chronischen neutrophilen Leukämie (CNL) entdeckt. Seine Studie kam zu dem Schluss, dass CALR-Mutationen, die nicht zur Bildung eines ausgeprägten C-Terminus führen, auf einen anderen, möglicherweise noch unbekannten Pathogenitätsmechanismus hindeuten33. In unserer Studie gingen wir davon aus, dass unser Patient keine CALR-Mutation entwickelte, die auf eine klonale hämatologische Erkrankung hindeuten würde. Nach der Anamnese, der klinischen Untersuchung und den Laborbefunden der Patientin deutete alles auf eine reaktive Thrombozytose hin. Zum Zeitpunkt der Abfassung dieses Artikels war der Patient bei guter Gesundheit und hatte keine möglichen Komplikationen im Zusammenhang mit einer klonalen hämatologischen Erkrankung.
Bei einem weiteren Patienten mit einer nicht-frameshift CALR-Mutation wurde MPN-U diagnostiziert. Dieser Patient trug eine Keimbahn-In-Frame-Deletion im CALR-Gen (NM_004343.3 (CALR):c.1142_1144delAGG; p.(Glu381del)), die bereits bei einem symptomatischen Patienten mit MPN34 erkannt worden war. Obwohl das KDEL-Motiv erhalten blieb, führte die Deletion einer Aminosäure (p.(Glu381del)) zu einer Veränderung der Sekundärstruktur des Proteins sowie der dreidimensionalen Struktur, was auf den pathogenen Charakter dieser In-Frame-Deletion schließen ließ23,34,35. Bei unserer Patientin mit MPN-U war die Nachbeobachtung leider nicht möglich, und eine genaue hämatologische Diagnose oder mögliche Komplikationen konnten nicht definiert werden. Die Laborbefunde deuteten jedoch auf eine klonale hämatologische Erkrankung hin.
In unserer Studie entdeckten wir vier neue CALR-Mutationen in Exon 9, die unseres Wissens noch nicht in der COSMIC- (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) oder HGMD-Datenbank (http://www.hgmd.cf.ac.uk) registriert wurden. Die COSMIC-Datenbank ist die weltweit größte von Experten kuratierte Datenbank für somatische Mutationen bei menschlichen Krebserkrankungen. Sie beschreibt über 4 Millionen kodierende Mutationen36. Die HGMD-Datenbank stellt einen Versuch dar, alle bekannten (veröffentlichten) Genveränderungen, die für menschliche Erbkrankheiten verantwortlich sind, zusammenzustellen19. Die neuen Mutationen, die in unserer Studie definiert wurden, sind NM_004343.3 (CALR):c.1127_1145del19, p.(Arg376Glnfs*48), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsGTTGTC, p.(Lys385Serfs*47), NM_004343.3 (CALR):c.1154_1154delAinsTTTATC, p.(Lys385Ilefs*47), und NM_004343.3 (CALR):c.1132_1153del22, p.(Glu378Argfs*45). Bei all diesen Mutationen handelte es sich um Typ-2-ähnliche Mutationen.
ET und PMF sind mit einem erhöhten Risiko für thrombotische und thromboembolische Ereignisse verbunden, die wichtige Ursachen für Morbidität und Mortalität darstellen37. Die Verringerung des Risikos thrombotischer und thromboembolischer Komplikationen ist eines der wichtigsten Ziele der Behandlung, insbesondere bei Patienten mit ET38. Diese Patienten haben auch ein höheres Risiko für Blutungskomplikationen, die mit Komplikationen der Behandlung oder dem erworbenen von-Willebrand-Syndrom (AVWS) aufgrund einer extremen Thrombozytose (Thrombozyten > 1000 × 109/L)28,39,40 zusammenhängen können. Das Thromboserisiko bei Patienten mit ET liegt bei über 20 %41. In einer schwedischen Studie entwickelten 35 % der Patienten mit ET vaskuläre Komplikationen42. Bei PMF sind thrombotische Ereignisse etwa genauso häufig wie bei ET43. Die Prävalenz thrombotischer Komplikationen bei Patienten mit PMF reicht von 7 bis 30 %44,45,46. In unserer Studie lag die Prävalenz von thrombotischen Komplikationen bei CALR-positiven Patienten bei 30 %. Allerdings hatten drei Patienten mehr als 10 Jahre vor der MPN-Diagnose eine thrombotische Komplikation entwickelt. Die tatsächliche Prävalenz thrombotischer Komplikationen in unserer Studie war daher niedriger. Ein Patient entwickelte eine Glaskörperblutung, die auf eine unzureichende Antikoagulationstherapie mit Warfarin zurückzuführen war. Keiner der beiden Patienten mit einer Blutungskomplikation hatte zum Zeitpunkt der Komplikation eine extreme Thrombozytose. Im Vergleich zu JAK2 V617F- und MPL-Mutationen ist CALR eine günstige Mutation und wird mit einer geringeren Inzidenz thrombotischer Ereignisse in Verbindung gebracht1,2,47. Bei den meisten CALR-positiven Patienten, die thrombo-hämorrhagische Komplikationen entwickelten, wurde eine Typ-1-Mutation diagnostiziert (71,4 %). Wie bereits gezeigt, hatten Patienten mit Typ-1-ähnlichen Mutationen ein höheres Thromboserisiko als Patienten mit Typ-2-ähnlichen Mutationen10.
CALR-Mutationen sind derzeit neben JAK2 V617F und der MPL-Mutation als eine der drei wichtigsten Mutationsarten bei Patienten mit ET oder PMF bekannt. Es gibt jedoch immer noch 10-15 % der Patienten mit ET oder PMF, bei denen ein unbekannter molekulargenetischer Marker der Krankheit zugrunde liegt. Diese Patienten werden als „dreifach negativ „48 bezeichnet. Bei diesen Patienten wurde durch die Sequenzierung kodierender Exons in myeloischen Krebsgenen nach neuen molekularen Biomarkern gesucht, was vielversprechende Ergebnisse lieferte. Dies könnte einen personalisierten Ansatz für die Diagnose bei MPN-Patienten bieten49.
CALR-Mutationen bei MPN-Patienten werden auch auf ihr therapeutisches Potenzial hin untersucht50,51,52. CALR-Mutationen im Exon 9 könnten Ziele für die Krebsimmuntherapie sein, da sie nachweislich als immunogene Neoantigene wirken51. Bei der Behandlung von MPN könnte es von Vorteil sein, CALR-Impfstoffe mit immunmodulatorischen Behandlungen53 wie Interferon-alpha (IFN-α)54 oder Programmed-Death-1-Ligand (PD-L1)55 als kombinatorische Krebsimpfung zu kombinieren. CALR-Mutationen sind nicht nur wichtige diagnostische und prognostische Marker bei MPN-Patienten, sondern könnten in Zukunft auch ein wichtiges therapeutisches Ziel bei einer Untergruppe von MPN-Patienten werden.