CD11c+ Monozyten/Makrophagen fördern chronische Helicobacter hepaticus-induzierte Darmentzündung durch die Produktion von IL-23

H. Die durch Helicobacter hepaticus ausgelöste Entzündung verändert das Kompartiment der mononukleären Phagozyten im Darm

Das gramnegative Bakterium Helicobacter hepaticus (Hh) ist ein nicht-invasiver Organismus, der häufig in der Schleimhaut des unteren Darmtrakts der Maus vorkommt. Wildtyp-Tiere, die mit dem Bakterium infiziert sind, entwickeln keine intestinale Immunpathologie und dienen als Träger der Infektion.21 Mäuse mit genetischen Defekten im IL-10/IL-10R-Signalweg sind jedoch anfällig für eine experimentelle Hh-Infektion und entwickeln eine schwere Entzündung des Dickdarms und des Zökums (Typhlokolitis), die mit einer Epithelhyperplasie einhergeht.22, 23 In ähnlicher Weise löst eine Hh-Infektion von Wildtyp-Mäusen bei gleichzeitiger Verabreichung von monoklonalen Anti-IL-10R-Antikörpern (mAbs) eine IL-23-abhängige Darmentzündung zusammen mit einer robusten T-Helfer-Typ 1/Typ 17 (Th1/Th17)-polarisierten Effektor-T-Zell-Antwort aus.23 Mäuse, die mit Hh infiziert und mit Anti-IL-10R-Antikörpern behandelt wurden, nicht aber nicht infizierte oder einfach behandelte Kontrollen, entwickeln innerhalb von 2-3 Wochen nach der Infektion histologische Merkmale einer Kolitis (Abbildung 1a). Hh- und Anti-IL-10R-behandelte Mäuse zeigen außerdem eine ausgeprägte Infiltration von Leukozyten in der Lamina propria (Abbildung 1b), einschließlich vorherrschender Populationen von Neutrophilen und MHCII+ Monozyten (Abbildung 1c und ergänzende Abbildung S1a online). Im nicht entzündeten Dickdarm entwickeln sich aus Monozyten, die aus dem Blut in die Lamina propria eindringen, bevorzugt Gewebemakrophagen11 (definiert als CD11b+ CX3CR1hi Ly6Clo-Zellen, grüne Untergruppe), die hohe Mengen an CD64, MHCII, F4/80 und CD11c exprimieren (Abbildung 1d und ergänzende Abbildung S1b). Dieser Prozess wird jedoch während einer Entzündung dramatisch verändert, und wir beobachteten eine deutliche Anhäufung von MHCII+ Monozyten (definiert als CD11b+ CX3CR1int Ly6Chi Zellen, rote Untergruppe) in der Lamina propria des Kolons. Diese Zellen sind durch die Expression von CD64 und MHCII sowie durch intermediäre Werte von F4/80, CD24 und CD11c gekennzeichnet (Abbildung 1c-e und ergänzende Abbildung S1a). Im Normalzustand exprimieren MHCII+ Monozyten und Makrophagen den Mannose-Rezeptor (CD206), einen Marker, der mit einer entzündungshemmenden Makrophagenfunktion in Verbindung gebracht wird.24 Die Expression von CD206 war jedoch bei MHCII+ Monozyten und Makrophagen während der Kolitis geringer (Abbildung 1f), was darauf hindeutet, dass nicht nur die Monozyten-, sondern auch die Makrophagenfunktionen während der Entzündung verändert wurden. Tatsächlich fanden wir heraus, dass MHCII+-Monozyten während der Entzündung höhere Mengen an Tumornekrosefaktor-α- und IL-6-Protein sowie Nos2 (induzierbare Stickoxid-Synthase) mRNA exprimierten, und dass IL-6 auch in Makrophagen erhöht war (ergänzende Abbildung S1c). Die IL-10-Produktion sowohl von MHCII+-Monozyten als auch von Makrophagen war während der Entzündung ebenfalls erhöht (ergänzende Abbildung S1c), was höchstwahrscheinlich einen entzündungsbedingten negativen Rückkopplungsweg widerspiegelt.

Neben ihrer Differenzierung in Makrophagen haben sich MHCII+ Monozyten auch in eine Ly6Clo CX3CR1int heterogene Untergruppe differenziert, die sowohl mit Makrophagen als auch mit klassischen DCs verwandt ist.11 Unter diesem heterogenen Kompartiment können CD11b+ DCs (definiert als CD11c+ CD103- CD11b+ CX3CR1int-Zellen, graue Untergruppe) unter homöostatischen Bedingungen leicht von Makrophagen unterschieden werden. CD11b+ DCs exprimieren MHCII, CD24 und CD11c, aber nicht CD64 und F4/80, Marker, die üblicherweise mit Makrophagen assoziiert werden (Abbildung 1d und ergänzende Abbildung S1b). Die Unterscheidung zwischen Makrophagen und CD11b+ DCs wurde jedoch während der Entzündung durch das Auftreten einer CD64-exprimierenden Population verwischt (Abbildung 1d,e), und es ist derzeit unklar, wie sich diese Zellen ontogenetisch und funktionell zu Makrophagen oder CD11b+ DCs im Dauerzustand verhalten.

Während der Kolitis korrelierte die deutliche Anhäufung von MHCII+ Monozyten mit einer geringeren Häufigkeit von Makrophagen, CD11b+ DCs und CD103+ DCs (definiert als CD11c+ CD103+ CX3CR1-Zellen, orangefarbene Untergruppe) unter den CD45+ Lamina-Propria-Zellen (Abbildung 1c,d). Die absoluten Zahlen zeigten jedoch einen geringen Anstieg der CD11b+ DCs und CD103+ CD11b+ DCs. Im Gegensatz dazu blieb die Zahl der Makrophagen unverändert und die Zahl der CD103+ CD11b- DCs ging leicht zurück (ergänzende Abbildung S1a).

Insgesamt löst die Hh-Infektion in Gegenwart einer IL-10R-Blockade eine Darmentzündung aus, die mit dramatischen Veränderungen im myeloischen Kompartiment einhergeht. Wir beobachteten eine überwiegende Ansammlung von Granulozyten und MHCII+ Monozyten in der Lamina propria des Kolons. Darüber hinaus erwarben MHCII+ Monozyten und Makrophagen ein eher proinflammatorisches Profil.

CD11c+ mononukleäre Phagozyten treiben die Kolitis durch die Produktion von IL-23 an

Da IL-23 in diesem Modell als Haupttreiber der Kolitis identifiziert wurde,23 untersuchten wir als nächstes die funktionelle Bedeutung der IL-23-Produktion durch mononukleäre Phagozyten bei der Entwicklung der Kolitis im Hh+-Anti-IL-10R-Modell. Dazu kreuzten wir Mäuse, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) und Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des CD11c-Promotors (kodiert durch Itgax)25, 26 exprimieren, mit Mäusen, die zwei loxP-Stellen besitzen, die vier Exons des Il23a-Gens27 flankieren, um Cd11c-cre.Il23afl/fl (CD11cIL-23-) Mäuse zu erzeugen.

Da CD11cIL-23-Mäuse GFP unter der Kontrolle des CD11c-Promotors exprimieren und daher nicht mit CX3CR1-GFP-Reportermäusen gekreuzt werden können, verließen wir uns auf eine alternative Gating-Strategie, um das myeloische Kompartiment in diesen Mäusen zu beurteilen (ergänzende Abbildung S2). Im Steady-State wiesen CD11cIL-23-Mäuse eine ähnliche Anzahl von Leukozyten im Dickdarm auf wie ihre IL-23-profizienten Wurfgeschwister (CD11cIL-23+) (ergänzende Abbildung S3a), und es wurden keine signifikanten Veränderungen in den Häufigkeiten von myeloischen oder T-Zellen beobachtet (ergänzende Abbildung S3b). Da IL-23 jedoch für die Aufrechterhaltung differenzierter Th17-Zellen erforderlich ist,28 wiesen CD11cIL-23-Mäuse stark reduzierte Spiegel von IL-17+ und IL-17+ IFNγ+ CD4+ T-Zellen im Dickdarm auf (ergänzende Abbildung S3c).

Nach einer Infektion mit Hh und einer Anti-IL-10R-Behandlung zeigten CD11cIL-23-Mäuse im Vergleich zu CD11cIL-23+-Mäusen eine auffällige Verringerung der Kolitis mit einer geringeren epithelialen Kryptenhyperplasie und einer geringeren Leukozyteninfiltration im gesamten Dickdarm und Blinddarm (Abbildung 2a,b). CD11cIL-23-Mäuse zeigten auch keine Entwicklung von Splenomegalie (Abbildung 2c), was darauf hindeutet, dass sie auch vor systemischen Krankheitsanzeichen geschützt waren. Die geringere Pathologie, die bei CD11cIL-23-Mäusen beobachtet wurde, war nicht die Folge einer unterschiedlichen bakteriellen Belastung, da die Hh-Kolonisierung in den CD11cIL-23- und CD11cIL-23+-Gruppen ähnlich war (Abbildung 2d). Im Einklang mit den geringeren pathologischen Veränderungen waren sowohl angeborene als auch adaptive Effektorzytokine im Dickdarm von CD11cIL-23-Mäusen nach Hh- und IL-10R-Blockade stark reduziert (Abbildung 2e), ebenso wie die Menge an IL-23 selbst (Abbildung 2f).

In Übereinstimmung mit ihrer verringerten Leukozyteninfiltration zeigten CD11cIL-23-Mäuse nach einer Hh-Infektion und IL-10R-Blockade im Vergleich zu ähnlich behandelten CD11cIL-23+-Wurfgeschwistern eine verringerte Häufigkeit und Anzahl sowohl von MHCII- als auch von MHCII+-Monozyten (Abbildung 3a) und neutrophilen Granulozyten (ergänzende Abbildung S3d) innerhalb der Lamina propria. Die geringere Infiltration von Monozyten in CD11cIL-23-Mäusen korrelierte mit einer höheren Häufigkeit von Makrophagen in der Lamina propria, während die Häufigkeit von CD11b+ DCs und CD103+ DCs unverändert blieb und die absoluten Zahlen reduziert waren (ergänzende Abbildung S3d).

Da IL-23 die Darmentzündung durch direkte Wirkungen auf T-Zellen antreibt und deren Anhäufung und Vermehrung im Dickdarm fördert,29 haben wir das T-Zell-Kompartiment im Dickdarm von CD11cIL-23- und CD11cIL-23+-Mäusen während der Kolitis untersucht. CD11cIL-23- Mäuse wiesen im Vergleich zu ihren IL-23-profizienten Wurfgeschwistern eine geringere Häufigkeit von CD4+ T-Zellen im Kolon auf (Abbildung 3b). Während CD11cIL-23+ Mäuse eine robuste Th1/Th17-Effektorantwort zeigten, die durch das Auftreten von IL-17A+/IFNγ+ T-Zellen gekennzeichnet war, zeigten CD11cIL-23- Mäuse nur eine geringe Induktion der entsprechenden Zytokine (Abbildung 3c).

Insgesamt deutet das Fehlen einer Kolitis bei CD11cIL-23- Mäusen darauf hin, dass die Produktion von IL-23 durch CD11c-exprimierende MNPs eine nicht redundante Rolle bei der Entzündungsreaktion im Darm spielt.

MHCII+ Monozyten und Makrophagen sind die Hauptquelle von IL-23 bei einer Infektion mit H. hepaticus

Um die Abfolge der Ereignisse, die mit der Entwicklung einer Kolitis bei IL-23-profizienten Mäusen verbunden sind, besser zu verstehen, haben wir zunächst die IL-23-Expression in Leukozyten, die aus der Lamina propria des Kolons gereinigt wurden, überwacht. Die mRNA-Expression von Il23a war durchweg 4-5 Tage nach Beginn der Kolitis nachweisbar (Abbildung 4a), was darauf hindeutet, dass eine im Gewebe ansässige und/oder eine schnell mobilisierte zelluläre Untergruppe an der frühen Produktion von IL-23 im Dickdarm beteiligt ist. Wir wählten daher diesen Zeitpunkt für die nachfolgenden Analysen. 4 Tage nach der Infektion mit Hh und der Anti-IL-10R-Behandlung zeigten CD11cIL-23+-Mäuse im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollmäusen eine erhöhte Infiltration von Leukozyten in der Lamina propria (Abbildung 4b). Dieser Zustrom korrelierte mit einer erhöhten Anzahl aller MNP-Untergruppen im Dickdarm (ergänzende Abbildung S4a,b) sowie einer erhöhten Häufigkeit von MHCII- und MHCII+ Monozyten (Abbildung 4c,d), Neutrophilen (Abbildung 4d), CD103+ CD11b- DCs und CD103+ CD11b+ DCs (Abbildung 4e). Die Häufigkeit von Makrophagen und CD11b+ DCs unter den Gesamtleukozyten blieb jedoch zu diesem Zeitpunkt unverändert (Abbildung 4d).

Um die myeloischen Untergruppen, die an der IL-23-abhängigen Darmentzündung beteiligt sind, weiter zu charakterisieren, untersuchten wir die CD11c-Cre-assoziierte GFP-Expression durch Lamina-Propria-Zellen von CD11cIL-23+-Mäusen. Die Analyse von CD45+-Zellen bestätigte, dass die Cre-GFP-Expression auf Leukozyten beschränkt war, die CD11c auf ihrer Zelloberfläche exprimieren (Abbildung 4f), aber überwiegend in CD11chi Zellen beobachtet wurde. Darüber hinaus wurde die Cre-assoziierte GFP-Fluoreszenz nur in MHCII+-Zellen beobachtet (Abbildung 4g), und interessanterweise war die Il23a-mRNA-Expression auf Cre-GFP+-Zellen beschränkt (Abbildung 4h). Die Mehrheit der MNPs in der Lamina propria exprimiert hohe Mengen an CD11c (Abbildung 1e und ergänzende Abbildung S1b). Die Analyse verschiedener myeloischer Untergruppen in CD11cIL-23+ Mäusen ergab, dass die CD11c-Cre-assoziierte GFP-Expression vorwiegend unter Makrophagen, CD103+ CD11b-DCs, CD103+ CD11b+-DCs (Abbildung 4i) und CD11b+-DCs (nicht gezeigt) nachgewiesen wurde. Darüber hinaus war mehr als die Hälfte der MHCII+ Monozyten positiv für Cre-GFP, was darauf hindeutet, dass alle diese Untergruppen eine potenzielle Quelle für IL-23 sein könnten. Im Gegensatz dazu fehlte die Cre-Expression bei Eosinophilen, Neutrophilen und MHCII-Monozyten (Abbildung 4i).

Um zu charakterisieren, welche dieser Untergruppen eine funktionelle Quelle von IL-23 in vivo darstellen, haben wir die Il23a-mRNA-Expression der entsprechenden Populationen, die mittels Durchflusszytometrie aus CD11cIL-23- und CD11cIL-23+-Mäusen 4 Tage nach einer Hh-Infektion in Gegenwart einer IL-10R-Blockade sortiert wurden, untersucht. Auffallend ist, dass die mRNA-Expression von Il23a in CD11cIL-23+ Zellen hauptsächlich auf MHCII+ Monozyten und Makrophagen beschränkt war, während die Expression unter CD103+ CD11b- DCs und CD103+ CD11b+ DCs gering war (Abbildung 4j). Darüber hinaus war die Il23a-Expression sowohl bei MHCII+ Monozyten als auch bei Makrophagen in CD11cIL-23- Mäusen deutlich reduziert, was darauf hindeutet, dass die CD11c-Cre-Expression in diesen zellulären Untergruppen aktiv war (Abbildung 4j). Die geringe Il23a-Expression, die in MHCII-Monozyten beobachtet wurde (Abbildung 4k), deutet darauf hin, dass die Induktion von IL-23 in der Lamina propria während ihrer lokalen Reifung und dem Erwerb von MHCII stattfindet.

Da das Niveau der CX3CR1-Expression diskrete Untergruppen von MNPs identifiziert, wiederholten wir unsere Analyse in CX3CR1GFP/+-Mäusen. In nicht infizierten Mäusen wurden geringe Mengen an konstitutivem Il23a unter MHCII+ Monozyten, CD103+ CD11b+ DCs (ergänzende Abbildung S4c,d) und CD11b+ DCs (ergänzende Abbildung S4d) nachgewiesen. Eine erhöhte Expression von Il23a 4 Tage nach der Infektion mit Hh und IL-10R-Blockade wurde jedoch nur in MHCII+ Monozyten (ergänzende Abbildung S4d) und Makrophagen (nicht gezeigt) nachgewiesen. Im Verlauf der Entzündung blieb die hohe Il23a-Expression in MHCII+ Monozyten und ihren Nachkommen erhalten, nicht jedoch in CD103+ DCs (Abbildung 5a). Unter den CX3CR1int-Untergruppen war die Expression von Il23a außerdem auf CD64+ Zellen beschränkt (Abbildung 5b).

Zusammengenommen deuten unsere Daten darauf hin, dass die Induktion von IL-23 bei Kolitis in CX3CR1-exprimierenden CD11c+ Zellen enthalten ist, die auch MHCII und CD64 exprimieren.

Batf3-abhängige CD103+ DCs sind für die chronische Kolitis entbehrlich

CD103+ CD11b+ DCs finden sich vorwiegend im Dünndarm der Maus und sind im Dickdarm fast nicht vorhanden.6 Stattdessen sind die meisten CD103+ DCs im Dickdarm CD11b- und benötigen den Transkriptionsfaktor Batf3 für ihre Entwicklung.30 Batf3-/- Mäusen fehlen daher gewebsresidente CD8α+ und CD103+ CD11b- nicht-lymphoide DC-Untergruppen. Wie erwartet waren CD103+ CD11b- Zellen in der Lamina propria des Kolons von Batf3-/- Mäusen stark reduziert, während CD103+ CD11b+ DCs nicht betroffen waren (Abbildung 6a,b). Um festzustellen, ob CD103+ CD11b- DCs an der Entwicklung der Kolitis beteiligt sein könnten, infizierten wir Batf3-/–Mäuse mit Hh in Kombination mit einer Anti-IL-10R-Behandlung. Zwei Wochen nach Beginn der Kolitis war die Anzahl der CD103+ CD11b- DCs in der Lamina propria immer noch signifikant reduziert (Abbildung 6b), aber es wurden keine Unterschiede in der Leukozyteninfiltration (Abbildung 6c) oder der Schwere der Kolitis (Abbildung 6d) bei Batf3-/- Mäusen im Vergleich zu ihren Wildtyp-Pendants beobachtet, was darauf hindeutet, dass Batf3-abhängige DCs für die Induktion der IL-23-getriebenen Darmentzündung in diesem Modell entbehrlich sind.

Reife Makrophagen produzieren IL-23 als Reaktion auf H. hepaticus in vitro, haben aber in vivo eine funktionelle Redundanz mit MHCII+ Monozyten

Um den Beitrag der Makrophagen zur IL-23-Produktion zu entschlüsseln, haben wir aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMDMs) von CD11cIL-23- und CD11cIL-23+-Mäusen erzeugt. Nach der Differenzierung mit L929-zellkonditioniertem Medium war etwa die Hälfte der BMDMs positiv für Cre-GFP und exprimierte CD64, F4/80 und CD11c (ergänzende Abbildung S5a). BMDMs wurden in vitro mit lebenden Hh-Bakterien in Anwesenheit von Anti-IL-10R-Antikörpern stimuliert und ihre Reaktion wurde mit den entsprechenden Kontrollen verglichen. Bemerkenswerterweise führte die Stimulation von CD11cIL-23+ BMDMs mit Hh zu einer mRNA-Expression von Il23a, und diese Reaktion wurde in Gegenwart einer IL-10R-Signalblockade verstärkt, während Il23a von nicht stimulierten BMDMs oder solchen, die nur mit Anti-IL-10R-Antikörper behandelt wurden, nicht exprimiert wurde (ergänzende Abbildung S5b). In ähnlicher Weise induzierte die Infektion von Mäusen mit Hh nur einen geringen Ausbruch von IL-23 in Monozyten und Makrophagen in vivo, und diese Reaktion war in Abwesenheit von IL-10R-Signalen stark erhöht (ergänzende Abbildung S5c).

Darmgewebsmakrophagen stammen ausschließlich von Blutmonozyten ab und erneuern sich nicht selbst.8, 10 Die Signalisierung des Kolonie-stimulierenden Faktor-1-Rezeptors (CSF-1R) steuert die Differenzierung von Ly6Chi in Ly6Clo-Monozyten31 und ist für die Reifung und den Ersatz von Ly6Clo-Monozyten des residenten Typs und von Gewebemakrophagen erforderlich, ist aber für die Produktion von Ly6Chi-Monozyten oder die Entzündungsfunktion entbehrlich.32 Um den relativen Beitrag von MHCII+-Monozyten und Gewebemakrophagen zur Entwicklung einer IL-23-abhängigen Darmentzündung zu beurteilen, haben wir CX3CR1GFP/+-Mäuse vor der Induktion der Kolitis mit einem Anti-CSF-1R-blockierenden mAb oder einer Isotypkontrolle vorbehandelt. Eine Gruppe von Mäusen wurde am Tag 0 analysiert (ergänzende Abbildung S6a,b), während die übrigen Mäuse mit Hh und Anti-IL-10R behandelt wurden und weiterhin mit Anti-CSF-1R behandelt wurden. 4 Tage nach der Hh-Infektion und der Anti-IL-10R-Behandlung waren im Dickdarm der mit Anti-CSF-1R behandelten Mäuse fast keine Makrophagen mehr vorhanden. Das heterogene Ly6Clo CX3CR1int-Makrophagen/DC-Kompartiment war bei diesen Mäusen ebenfalls deutlich reduziert (Abbildung 7a,b und ergänzende Abbildung S6c). Obwohl die Gesamtzahl der Leukozyten im Kolon unverändert blieb (Abbildung 7c), stieg der Anteil der Granulozyten unter diesen Bedingungen an (Abbildung 7d). Interessanterweise korrelierte die Verarmung der Makrophagen mit einer erhöhten Il23a-Expression in der Lamina propria an Tag 4 (Abbildung 7e). Die Anti-CSF-1R-vermittelte Depletion von Makrophagen während des gesamten Verlaufs der Kolitis hatte jedoch keinen Einfluss auf die Anzahl der sich im Dickdarm ansammelnden Entzündungszellen (Abbildung 7f) oder den Schweregrad der Darmpathologie (Abbildung 7g) 2 Wochen nach der Hh-Infektion und der IL-10R-Signalblockade, was darauf hindeutet, dass MHCII+ Monozyten und Makrophagen während der Entzündung eine funktionelle Redundanz aufweisen.