Chloridionenkanäle und -transporter: von Kuriositäten der Natur und Ursachen menschlicher Krankheiten zu Zielstrukturen für Arzneimittel

Dies trifft praktisch auf alle Fälle zu, vom Klassenzimmer bis zum Forschungslabor, bis wir Chloridkanäle betrachten. Wir wissen, dass es sie gibt, dass sie wichtig sind und dass sie in verschiedenen Krankheitsbereichen gute Angriffspunkte für Medikamente sein könnten, aber bis vor kurzem waren sie in der Welt der Therapeutika noch etwas stigmatisiert und unmodern. Der Mangel an selektiven Liganden hat dabei nicht gerade geholfen. Die einzige Ausnahme ist der GABA-A-Rezeptor, der an einen intrinsischen Chloridkanal gekoppelt ist, der sich bei Bindung des hemmenden Neurotransmitters GABA öffnet. Benzodiazepine potenzieren diesen Rezeptor, seit Valium in den 1960er Jahren auf den Markt kam, und sorgen für sedierende und krampflösende Effekte. Hier wird ein wichtiges Konzept eingeführt: Es gibt mehrere Genfamilien und verschiedene Proteintypen, die als Chloridkanäle beschrieben werden können.

Dies steht im Gegensatz zu dem, was wir über kationenselektive Ionenkanäle wissen, bei denen es wenig Flexibilität in der Proteinstruktur gibt, die eine Pore bilden kann, die für Kalium, Natrium oder Kalzium selektiv ist; die Vielfalt dieser Ionenkanäle wird durch die Variationen in den von der Pore getrennten Proteindomänen hervorgerufen, die das Öffnungs- und Schließverhalten beeinflussen. Fairerweise muss man sagen, dass es nicht viele physiologische Gründe zu geben scheint, warum ein Anionenkanal eine Chloridselektivität aufweisen sollte, da es kaum eine physiologische Rolle beim Membrantransport anderer Halogenide oder kleiner Anionen gibt; jeder Anionenkanal ist aus physiologischer Sicht standardmäßig ein Chloridkanal. Andererseits spielen Kalium-, Natrium- und Kalzium-Membranströme jeweils eine andere grundlegende Rolle, und die selektive Membranpermeabilität für diese Kationen ist für die Zellfunktionen und das Leben selbst von entscheidender Bedeutung.

GABA-A-Rezeptoren gehören zu den pentameren, ligandengesteuerten Cys-Schleifen-Ionenkanälen, zu denen mehrere Arten von exzitatorischen und inhibitorischen Neurotransmitter-gesteuerten Kanälen gehören. Das CFTR-Protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) ist ein Nukleotid-regulierter Chloridkanal. Es gehört zur Familie der ATP-bindenden Kassetten-Transporter (ABC) und ist der einzige, der offenbar kein Substrat durch eine Membran transportiert, sondern als Chloridkanal fungiert. Die CLC-Familie der spannungsabhängigen Chloridkanäle entstammt einer anderen Genfamilie und weist eine unter den Membranproteinen einzigartige allgemeine Struktur auf. Diese Familie von Proteinen hat in den letzten 30 Jahren für viele Überraschungen gesorgt, und die Mitglieder dieser Familie werden hier vorgestellt, und es wird auch erläutert, inwiefern sie als Angriffspunkte für Medikamente in Frage kommen.

Weitere aufregende Entwicklungen auf dem Gebiet der Chloridkanäle ergaben sich aus der molekularen Identifizierung von Proteinen, die den Calcium-aktivierten Chloridkanälen (ClCa) zugrunde liegen. Die Funktion dieser Kanäle ist bereits seit einiger Zeit bekannt, aber die jüngste molekulare Identifizierung der Kanalproteine hat die Entwicklung molekularer und pharmakologischer Instrumente zur Untersuchung und Veränderung ihrer Aktivität ermöglicht. Diese Übersicht konzentriert sich auf das pharmakologische Potenzial von ClCa-Kanälen und CLC-Proteinen; ihre Funktion und subzelluläre Lokalisierung sind in Abbildung 1 zusammengefasst.

Eine Einführung in CLC-Proteine

Die neun Mitglieder dieser Proteinfamilie sind CLC-1 bis 7, CLC-KA und KB. Das Gründungsmitglied, CLC-1, ist der spannungsabhängige Chloridkanal des Skelettmuskels und wird im Folgenden behandelt. Zahlreiche funktionelle Studien wurden an einem Homologen mit dem Ehrentitel CLC-0 durchgeführt, das aus dem elektrischen Organ des Elektroplax isoliert wurde, das es dem Rochen ermöglicht, seine Opfer im Wasser zu betäuben. Die Rekonstitution von CLC-0 in Lipiddoppelschichten und die elektrophysiologische Aufzeichnung von Strömen, die durch einzelne Ionenkanäle fließen, haben eine faszinierende Eigenschaft offenbart. Normalerweise beobachtet man bei der Aufzeichnung von Strömen aus einem kleinen Membranfleck, der einen einzelnen Ionenkanal enthält, Fluktuationen zwischen zwei Stromamplituden: eine steht für den geschlossenen Kanal und die andere für den Strom, der durch den offenen Kanal fließt. Die Fluktuationen spiegeln Übergänge zwischen offenen und geschlossenen kinetischen Zuständen wider. Bei CLC-0 wurde jedoch deutlich, dass das einzelne Ionenkanalprotein aus zwei gleichwertigen Poren besteht, die sich unabhängig voneinander öffnen können1. Dieser Kanal wurde daher als „double-barrelled“ bezeichnet (Abbildung 2). Es war daher keine große Überraschung, dass die Kristallstrukturen von Homologen aus Darmbakterien zeigten, dass es sich bei dem Proteinkomplex um ein Dimer handelte, bei dem jede Untereinheit einen ionenleitenden Pfad besitzt2 (Abbildung 2).

Die zweite Überraschung ergab sich, als detaillierte funktionelle Experimente an CLC-ec1 aus E. coli durchgeführt wurden. CLC-ec1 ist kein Chloridkanal, wie sein lange verschollener Verwandter im Skelettmuskel der Wirbeltiere, sondern ein 2Cl-/H+-Austausch-Transporter oder Antiporter mit einer strikten 2:1-Austauschstöchiometrie3. Dieses Protein ist wichtig für das Überleben von Darmbakterien bei niedrigem pH-Wert4 und nutzt wahrscheinlich einen Chloridgradienten, um den zellulären pH-Wert auf einem tolerierbaren Niveau zu halten. Prokaryotische CLCs könnten daher Ziele für Inhibitoren zur Behandlung von pathogenen E. coli- oder Salmonella-Infektionen sein4. Die Entdeckung des Ionenaustauschverhaltens regte natürlich zu weiteren Untersuchungen an, um festzustellen, ob dieser Austausch von Chlorid gegen Protonen auch in CLCs von Säugetieren stattfindet, wobei man davon ausging, dass der Cl-/H+-Austausch die eigentliche Funktion der archetypischen CLCs sein könnte und die als Chloridkanäle identifizierten Kanäle nur Ausnahmen von der Regel darstellen. Dies scheint der Fall zu sein, denn es gibt deutliche Hinweise darauf, dass CLC-3 bis CLC-7 als 2Cl-/H+-Austausch-Transporter fungieren, die sich hauptsächlich in intrazellulären Organellen befinden, während CLC-1, CLC-2, KA und KB echte Chlorid-leitende Plasmamembran-Ionenkanäle sind5-9. Da die archetypische CLC-Eigenschaft der Austausch-Transport ist, der in allen Formen des zellulären Lebens zu finden ist, kann die letztgenannte Unterklasse von Proteinen, die echten Chlorid-Kanäle, daher als „gebrochene“ Chlorid-Transporter betrachtet werden, die die Kopplung des Chlorid-Transports an die Bewegung eines zweiten Substrat-Ions verloren haben.

CLC-1

Dieser Begründer der CLC-Familie ist der spannungsgesteuerte Chloridkanal des Skelettmuskels und dient der Regulierung des Membranpotentials und der Repolarisierung der Membran nach Aktionspotentialen zur Entspannung des Muskels. In den meisten Geweben würde man erwarten, dass Kaliumkanäle diese Rolle spielen, was sie auch in der Herzmuskulatur und der glatten Muskulatur tun und die Erregbarkeit der Membran in anderen Zelltypen regulieren. Das Quertubulussystem ist eine Verlängerung der Plasmamembran (Sarkolemm) und dringt in das kontraktile Gewebe ein. Es ist entscheidend für die rasche Ausbreitung der elektrischen Aktivität im Muskel und sorgt für eine schnelle und kontrollierte Kontraktion. Ein Kaliumausfluss aus den Muskelzellen in den engen Raum des T-Röhrchens würde die extrazelluläre Kaliumkonzentration erhöhen und diesen Ionengradienten zusammenbrechen lassen, was zu einer anhaltenden Membrandepolarisation führen würde. Da die Chloridkanäle die vorherrschende repolarisierende Rolle spielen, wird dies verhindert. Funktionsverlustmutationen in CLC-1 führen bei Menschen, Ziegen und Mäusen zu Myotonie (siehe 10) und sind durch eine beeinträchtigte Muskelrelaxation gekennzeichnet, die mit dem Verlust eines repolarisierenden Membranstroms einhergeht.

Da die Expression auf die Skelettmuskulatur beschränkt ist, könnte CLC-1 ein attraktives Ziel für Medikamente sein, die die Muskelkontraktion durch Erhöhung oder Verringerung der CLC-1-Funktion steuern und dadurch die Erregbarkeit der Muskeln verringern bzw. erhöhen. Präparate, die die CLC-1-Funktion erhöhen, könnten zur Behandlung von Myotonie eingesetzt werden, insbesondere wenn sie den teilweisen Verlust der Chloridkanalaktivität kompensieren könnten. Die Hemmung von CLC-1 könnte die Schwelle für die Muskelkontraktion herabsetzen und könnte bei Muskelschwäche oder degenerativen Erkrankungen wie Muskeldystrophie nützlich sein.

CLC-2

Der einwärtsgerichtete Chloridkanal CLC-2 ist in den Geweben relativ weit verbreitet. Er ist in zentralen Neuronen zu finden, wo er die neuronale Aktivität reguliert11-13. In Astrozyten wird seine subzelluläre Ausrichtung auf Zellverbindungen durch eine Wechselwirkung mit GlialCAM (MLC1) reguliert, wobei Mutationen diese Ausrichtung stören und eine megalencephale Leukoenzephalopathie verursachen14. Jüngstes therapeutisches Interesse gilt der Expression von CLC-2 in der Darmschleimhaut und den Lungenbronchiolen, wo es eine Rolle bei der Darm- bzw. Lungensekretion spielt. Es wird angenommen, dass Lubiproston, ein Medikament, das klinisch zur Linderung von Verstopfung eingesetzt wird, seine Wirkung durch die Aktivierung von CLC-2 entfaltet, aber diese Wirkung ist umstritten. Während dieser Wirkstoff in einigen Studien die CLC-2-Kanäle aktiviert, reguliert er in anderen Studien den CLC-2-Traffic und erhöht die CFTR-Funktion über die Aktivierung des Prostaglandinrezeptors15,16. Es gibt jedoch genügend Beweise dafür, dass die Erhöhung der CLC-2-Funktion in den Atemwegen einen alternativen Chloridweg bei zystischer Fibrose darstellen könnte17.

CLC-KA/KB

Diese Chloridkanäle werden vor allem in Nierenepithelien exprimiert und tragen zur Durchlässigkeit der Zellmembranen für den passiven Chloridfluss bei. Sie spielen eine Schlüsselrolle im aufsteigenden Glied und den distalen Tubuli des Nephrons, indem sie nach dem Transport aus dem Primärharn über die apikale Membran einen basolateralen Weg für die Chloridrückresorption bereitstellen. Das CLCKB-Gen, das für CLC-KB kodiert, ist eines von fünf Genen, die dem Bartter-Syndrom zugrunde liegen. Funktionsverlustmutationen in CLC-KB führen zu einer gestörten Chloridrückresorption und damit zu einer Salzverschwendungsstörung, die mit Polyurie einhergeht. Eines der Hauptmerkmale von Personen, die von CLC-KB-Mutationen betroffen sind (Bartter-Typ III), ist niedriger Blutdruck. Eine schwerere Form der Krankheit wird durch Mutationen im BSND-Gen verursacht (Bartter-Typ IV), das für Barttin kodiert, ein akzessorisches Protein, das für den Transport von CLC-KA und KB zur Plasmamembran wichtig ist18. Zu dieser Form der Störung gehört auch die sensorische Taubheit, die vermutlich durch den Verlust des Trafficking von CLC-KA und KB zu den Epithelmembranen im Innenohr verursacht wird. Vermutlich kann das auditorische System den Verlust entweder der CLC-KA- oder der KB-Aktivität, aber nicht beider tolerieren. Dies deutet darauf hin, dass Hemmstoffe, die entweder für CLC-KA oder CLC-KB selektiv sind oder beide teilweise hemmen, als neuartiges Schleifendiuretikum mit dem Potenzial zur Blutdrucksenkung und geringen Nebenwirkungen wirken könnten. Dies hat zur Untersuchung ihrer Pharmakologie und zur Entwicklung neuartiger Hemmstoffderivate mit niedriger mikromolarer Affinität19 geführt, die bei Verabreichung an Ratten harntreibende Wirkung zeigten20. Andererseits können Medikamente, die CLC-KB-Kanäle aktivieren, die Restaktivität defekter Kanäle bei Patienten mit Bartter-Typ III verstärken.

CLC-7

Als Unterklasse der 2Cl-/H+-Austausch-Transporter ist CLC-7 ein vielversprechender Angriffspunkt für Arzneimittel, und seine Hemmung könnte bei Osteoporose von Nutzen sein. Auch diese Indikation geht auf Beobachtungen menschlicher Erkrankungen zurück, die durch Funktionsverlust-Mutationen in CLC-7 hervorgerufen werden und die Osteropetrose21 verursachen. Bei dieser Erkrankung ist der Knochenumbau durch Osteoklasten gestört, was vermutlich auf eine gestörte Säure- und Enzymsekretion zurückzuführen ist. Dies führt zu dichtem Knochen, der, wenn er durch einen CLC-7-Hemmer reproduziert wird, die Auflösung des Knochens verringern und somit das Skelett von Osteoporosepatienten stärken könnte22,23. In Proof-of-Concept-Studien haben die pharmakologische Hemmung der Ansäuerung24 oder die Unterbrechung der CLC-7-Funktion durch Antikörper25 die Knochenresorption verringert. Die Hemmung von CLC-7 ist jedoch möglicherweise nicht ohne Komplikationen, da Studien an Menschen und Mäusen darauf hindeuten, dass eine fehlende CLC-7-Funktion aufgrund einer reduzierten lysosomalen Funktion auch mit neuronalen Speicher- und Degenerationsstörungen verbunden sein kann26.

Funktionsverluste bei menschlichen Mutationen – Lehren aus CFTR

Es lohnt sich, an dieser Stelle kurz innezuhalten und zu bedenken, dass einige der therapeutischen Indikationen für neuartige, auf CLC ausgerichtete Arzneimittel auf die Behandlung von Störungen abzielen, die sich von denen unterscheiden, die durch eine defekte CLC-Funktion verursacht werden, und am anderen Ende des Spektrums liegen. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Erkrankungen ist die Dent’sche I-Krankheit eine X-chromosomale Nierenerkrankung, die durch den Verlust der CLC-5-Funktion verursacht wird (siehe27 für eine aktuelle Übersicht). Bei allen Erkrankungen handelt es sich um seltene Erbkrankheiten, und der Hauptdefekt des Proteins besteht entweder in einer verminderten Proteinaktivität oder im Trafficking zur Zielmembran. Tatsächlich verursachen viele einzelne Mutationen eine ER-Retention und einen Mangel an Proteinreifung. Eine Parallele könnte zur Mukoviszidose gezogen werden, bei der die meisten Betroffenen die ER-retentierte ΔF508-Mutation besitzen. Jüngste und geschichtete Ansätze zur Behandlung der zystischen Fibrose sind das Ergebnis eines zweigleisigen Ansatzes, der darauf abzielt, die Faltung des mutierten Proteins zu korrigieren (CF-Korrektoren) und/oder die Aktivität der CFTR-Chloridkanäle der Plasmamembran zu erhöhen (CF-Potentiatoren). Erfolge zeichnen sich bei der Klasse der Potenzierer28 ab, die bei Patienten mit Mutationen wirksam sind, die die CFTR-Aktivität ohne Verlust der Proteinbiosynthese oder des Proteintraffics (z. B. G551D) verringern; die Wirksamkeit der Faltungs-Korrektoren (die in den meisten Fällen erforderlich ist) muss jedoch noch nachgewiesen werden29. Obwohl es sich bei den Krankheiten, die mit dem Verlust der CLC-Funktion einhergehen, um seltene genetische Störungen handelt, könnten wir eines Tages in der Lage sein, Personen mit Myotonie, Bartter-Syndrom, Morbus Dent und Osteopetrose sowie Mukoviszidose mit Medikamenten zu behandeln, die die eigentliche Ursache ihrer Störung korrigieren.

Calcium-aktivierte Chlorid-Kanäle

Schließlich werden die Calcium-aktivierten Chlorid-Kanäle (ClCa) erwähnt, die eine klar definierte physiologische Rolle in einer Reihe von Zelltypen spielen, deren molekulare Identifizierung jedoch einige Fehlschläge und Stotterer erlitt. Es geht um vier Arten von Proteinen: Mitglieder der CLCA-, Bestrophin-, Tweety- und TMEM16-Genfamilien. In allen Fällen führte ihre rekombinante Überexpression zur Erzeugung von Membran-Chloridströmen, die durch eine Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration und – in unterschiedlichem Ausmaß – durch eine Depolarisation der Membran stimuliert werden. Die Suche nach CLCA endete, als sich herausstellte, dass es sich um ein Protein handelt, das zwar sezerniert wird, aber wahrscheinlich auch die Membranexpression von ClCa-Kanälen hochreguliert, die im Expressionssystem endogen sind30. Tweety- und Bestrophin-Proteine weisen nicht alle Eigenschaften von ClCa-Kanälen auf, die in den wichtigsten Geweben untersucht wurden, obwohl Best1 für eine Komponente von ClCa in sensorischen Neuronen31 verantwortlich zu sein scheint und möglicherweise auch ein wichtiger Regulator der Kalziumfreisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum32,33 ist. In drei unabhängigen Studien wurde TMEM16A (auch Ano1 genannt) als Kandidat für eine Hauptkomponente, wenn auch nicht in ihrer Gesamtheit, für einen Calcium-aktivierten Chloridkanal vorgeschlagen34-36. Viele nachfolgende Studien, die durch die Entwicklung von molekularen Werkzeugen erleichtert wurden, haben dies bestätigt. TMEM16A ist wichtig für die Regulierung der Erregbarkeit von Membranen in der glatten Gefäßmuskulatur, wird in einem Tiermodell der pulmonalen Hypertonie hochreguliert und der Tonus kann durch Kanalhemmung reduziert werden37,38. In sensorischen Neuronen koppelt TMEM16A das Vorhandensein von Entzündungsmediatoren an die Übererregbarkeit der Membran, und die Hemmung von TMEM16A hat antinozizeptive Wirkungen39. In Tiermodellen für Asthma ist die Expression dieses speziellen Chloridkanals erhöht, und seine Hemmung kann positive Auswirkungen haben40. Er kommt auch in den interstitiellen Cajal-Zellen des Darms vor, und die Kanalfunktion ist für die rhythmische Kontraktion der glatten Muskulatur in der Darmwand erforderlich41. Darüber hinaus könnte die Aktivierung von TMEM16A einen alternativen Weg für die epitheliale Chloridsekretion bei zystischer Fibrose darstellen42. Während die genaue Funktion der übrigen Mitglieder der TMEM16-Familie noch umstritten ist, wird die ClCa-Funktion auch TMEM16B (Ano2) zugeschrieben, von dem angenommen wird, dass er dem ClCa-Kanal in den Riechhaarzellen zugrunde liegt43,44. Möglicherweise spielt diese Klasse von Ionenkanälen auch eine Rolle in der Biologie von Krebszellen, und ihre Hemmung kann die Zellproliferation verhindern45-48.

Abschließende Bemerkungen

Dieser Überblick hat die vielfältigen Funktionen von Chlorid leitenden oder transportierenden Proteinen hervorgehoben und gezeigt, wie ihre Fehlfunktion mit menschlichen Störungen oder krankheitsähnlichen Symptomen in Tiermodellen verbunden ist. Es besteht ein großer Mangel an pharmakologischen Reagenzien, die den Membranverkehr von Chloridkanälen und Transportern hemmen, aktivieren oder verbessern. Fortschritte werden bei Medikamenten erzielt, die die defekte Funktion von CFTR bei zystischer Fibrose umkehren, was hoffentlich zu Medikamenten führen wird, die für die verschiedenen Arten der vererbten Mutation spezifisch sind. Inhibitoren und Aktivatoren von TMEM16A-Calcium-aktivierten Chloridkanälen42,49 erweisen sich als nützliche Laborinstrumente, und neue Verbindungen könnten wirksame Arzneimittel sein, insbesondere wenn sie gewebespezifische Wirkungen entfalten können. Moleküle, die spezifisch für bestimmte CLCs sind, sind wahrscheinlich am schwersten zu finden. Das Verständnis der strukturellen Grundlagen der Aktivierung spannungsabhängiger CLCs50 könnte zur Identifizierung von Proteindomänen führen, die durch rationales strukturbasiertes Wirkstoffdesign anvisiert werden können. Solche Werkzeuge werden uns in die Lage versetzen, einige der hier vorgestellten neuen therapeutischen Ideen zu testen.

Biografie des Autors

Dr. Jon Lippiat promovierte über die Struktur, Funktion und Pharmakologie von Kaliumkanälen an der Universität Leicester. Er studierte die Funktion der Betazellen der Bauchspeicheldrüse und Diabetes an der Universität Oxford, bevor er als Dozent für Pharmakologie an die Universität Leeds berufen wurde. Seine Forschungsarbeiten befassen sich mit der Aufklärung der strukturellen und physiologischen Eigenschaften verschiedener Arten von Ionenkanälen und Transportern und deren potenzieller Beeinflussung durch neuartige pharmakologische Reagenzien.