Cholinmangel mildert die Gewichtszunahme und verbessert die Glukosetoleranz bei ob/ob-Mäusen

Abstract

Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass die Cholinzufuhr in direktem Zusammenhang mit der durch eine fettreiche Diät verursachten Fettleibigkeit und Insulinresistenz bei Mäusen steht. In dieser Studie sollte untersucht werden, ob die Cholinzufuhr auch die durch einen Gendefekt verursachte Fettleibigkeit und Insulinresistenz beeinflussen kann. Acht Wochen alte männliche ob/ob-Mäuse wurden zwei Monate lang entweder mit einer cholinarmen oder einer cholinzusatzhaltigen Ernährung gefüttert. Das Gewebegewicht, einschließlich der Fettmasse und der mageren Masse, wurde bestimmt. Außerdem wurden die intrazelluläre Signalübertragung, Glukagon und Insulin im Plasma sowie Glukose- und Insulintoleranztests untersucht. Die Cholinmangeldiät verlangsamte die Körpergewichtszunahme und verringerte die Fettmasse. Der Cholinmangel senkte auch den Plasmaglukosespiegel und verbesserte die Glukose- und Insulintoleranz, obwohl die Fettleber verschlimmert wurde. Bei der Cholinmangeldiät wurden auch eine erhöhte lipolytische Aktivität der Fettgewebe, ein Rückgang des Plasmaglucagons und eine verminderte Expression des hepatischen Glucagonrezeptors beobachtet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine Cholinmangeldiät die Fettmasse verringern und die Glukosetoleranz bei fettleibigen und diabetischen Mäusen verbessern kann, die durch einen genetischen Defekt verursacht werden.

1. Einleitung

Cholin ist ein wichtiger Ernährungsfaktor, der an einigen entscheidenden Prozessen wie der Biosynthese des Neurotransmitters Acetylcholin und des wichtigsten Membranbestandteils Phosphatidylcholin (PC) beteiligt ist. PC kann entweder über den CDP-Cholin-Weg oder über die Methylierung von Phosphatidylethanolamin durch Phosphatidylethanolamin-N-Methyltransferase (PEMT) synthetisiert werden. Der PEMT-Weg ist nur in der Leber von quantitativer Bedeutung. Cholin ist auch ein wesentlicher Vorläufer des Neurotransmitters Acetylcholin, der über muskarinische und nikotinische Acetylcholinrezeptoren wirkt. In den letzten Jahren hat sich ein möglicher Zusammenhang zwischen Cholin und Fettleibigkeit/Diabetes herauskristallisiert. Das Potenzial der muskarinischen Acetylcholinrezeptoren als therapeutisches Ziel für Fettleibigkeit wurde vorgeschlagen. Kürzlich haben wir herausgefunden, dass ein PEMT-Mangel Mäuse vor Fettleibigkeit und Insulinresistenz schützt, die durch eine fettreiche Diät verursacht werden. Dieser Schutz verschwand jedoch, wenn der fettreichen Diät eine hohe Dosis Cholin zugesetzt wurde. Der PEMT-Weg, gefolgt vom PC-Katabolismus, ist der einzige bekannte Biosyntheseweg für Cholin in Säugetieren. Bei PEMT-defizienten Mäusen wurde ein signifikanter Rückgang des Cholingehalts in verschiedenen Geweben festgestellt (Li et al., unveröffentlichte Daten), was einen direkten Zusammenhang zwischen Cholin und fettreicher Ernährung und Adipositas/Insulinresistenz nahelegt. In der aktuellen Studie fütterten wir ob/ob-Mäuse mit einer cholinarmen (CD) Diät, um zu untersuchen, ob Cholinmangel auch die genetisch bedingte Fettleibigkeit und Insulinresistenz modulieren könnte.

2. Material und Methoden

2.1. Tiere und Ernährung

Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care Committee der University of Alberta in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care genehmigt. 8 Wochen alte männliche ob/ob-Mäuse von The Jackson Laboratory wurden 1 Woche lang akklimatisiert. Es wurden 5 Mäuse in jeder Gruppe verwendet. Die Mäuse hatten 2 Monate lang freien Zugang zu cholinarmer (CD) oder cholinzusatzhaltiger (CS) Nahrung. Die CD-Diät (MP Biomedicals Canada, Katalognummer 901387) enthielt 20 % Fett in Form von Schmalz. Die CS-Diät bestand aus der CD-Diät, der 0,4 % (w/w) Cholinchlorid zugesetzt wurde. Die Mäuse wurden durch Betäubung mit Isofluran und anschließender Herzpunktion geopfert.

2.2. Körpergewichtszunahme, Messung der fettfreien Masse und der Fettmasse

Das Körpergewicht wurde wöchentlich gemessen. Die fettfreie Masse und die Fettmasse wurden 2 Monate, nachdem die Mäuse auf Diät gesetzt worden waren (prämortem), mit dem EchoMRI-System analysiert.

2.3. Glukose- und Insulin-Toleranztest

Glukose-Toleranztest: Nach einem 12-stündigen Fasten erhielten die Mäuse eine intraperitoneale Injektion (i.p.) von 0,5 g Dextrose/kg Körpergewicht, gelöst in sterilisierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Insulin-Toleranztest: Nach einem 6-stündigen Fasten erhielten die Mäuse eine i.p.-Injektion von 1,0 Einheiten Insulin (Sigma)/kg Körpergewicht in PBS. Die Blutzuckerkonzentrationen wurden mit einem Glucometer in den Schwanzbluten vor und zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Injektion gemessen.

2.4. Messung der Aktivität des mitochondrialen Komplexes I/II

Die Aktivitäten des mitochondrialen Komplexes I und II wurden mit Hilfe von mitochondrialem Protein bestimmt. Um mitochondriales Protein zu isolieren, wurden die Proben auf Eis gelegt und in einem Puffer homogenisiert, der 75 mM Saccharose, 225 mM Sorbit, 1 mM EGTA und 0,1% fettsäurefreies Rinderserumalbumin in 10 mM Tris-HCl pH 7,4 enthielt. Das Homogenat wurde 15 Minuten lang bei 600× g zentrifugiert, und der resultierende Überstand wurde 20 Minuten lang bei 16.200 rpm weiter zentrifugiert. Das mitochondriale Protein in den Pellets wurde in einem Puffer mit 20 mM Tris und 25 mM Saccharose (pH 7,4) suspendiert und bis zur Verwendung bei -80°C aufbewahrt. Die Messung der Aktivität erfolgte in einem Spektrophotometer über einen Zeitraum von 5 Minuten als Abnahme der Absorption bei 600 nm aufgrund der Reduktion von 2,6-Dichlorphenol-Indophenol (DCPIP) zu Ubichinon-1 in Gegenwart von NADH (Substrat von Komplex I) oder Succinat (Substrat von Komplex II). Die Reaktion wurde in Anwesenheit von Antimycin und Kaliumcyanid als Inhibitor von Komplex III und Komplex IV durchgeführt. Rotenon, als Inhibitor von Komplex I, wurde ebenfalls in den Reaktionspuffer für die Aktivität von Komplex II gegeben.

2.5. Histologie und Immunoblotting

Für die Histologie wurden die Lebern oder Fettpölsterchen in 10 % Formaldehyd in PBS präpariert und anschließend routinemäßig mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Für den Immunoblotting-Test wurden die Leberproben homogenisiert und bei 600× g zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde einer Proteinkonzentrationsbestimmung (BioRad) unterzogen, um sicherzustellen, dass die gleiche Menge an Proteinen in die SDS-PAGE geladen wurde. Alle primären Antikörper gegen hormonempfindliche Lipase (phospho-HSL/insgesamt HSL), Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK), Acetyl-CoA-Carboxylase (phospho-ACC/insgesamt ACC) und AMP-aktivierte Proteinkinase (phospho-AMPK/insgesamt AMPK) wurden von Cell Signaling erworben. Die Antikörper gegen Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase-Isoenzym 4 (PDK4) und den Glucagon-Rezeptor stammen von Abcam, während die Antikörper gegen Suppressor of Cytokine Signaling 3 (SOCS3) und PGC-1α von Santa Cruz Biotechnology stammen. Die Bilder wurden mit der Software ImageJ analysiert.

2.6. Messung von Plasma-Insulin und -Glucagon

Die Messungen wurden mit einem Glucagon- und Insulin-Assay-Kit für Mäuse/Ratten (Meso Scale Discovery) gemäß den Anweisungen des Unternehmens durchgeführt.

2.7. Statistische Analyse

Die Daten sind als Mittelwert ± SD angegeben. Die Unterschiede wurden mit dem Student’s t-Test bewertet. Ein Wert von 𝑃<0,05 wurde als signifikant angesehen.

3. Ergebnisse

Cholinarme Ernährung verlangsamte signifikant die Körpergewichtszunahme bis zu 2 Monaten (Abbildung 1(a)), ohne die Nahrungsaufnahme zu beeinflussen (tägliche Nahrungsaufnahme 7,21±1,23 g für CD-Mäuse gegenüber 7,39±1,31 g für CS-Mäuse, 𝑃>0,05). Es gab einen signifikanten Unterschied im Ausgangskörpergewicht zwischen den beiden Gruppen (30,42±1,70 g für CD-Mäuse gegenüber 26,3±2,26 g für CS-Mäuse, 𝑃=0,01). Der Cholinmangel hatte keinen Einfluss auf das Gewicht von Herz, Leber oder Niere (Abbildung 1(b)), aber es gab eine signifikante Abnahme des Gewichts von epididymalem und perirenalem Fett (Abbildung 1(c)). Eine weitere Analyse mit Hilfe der Magnetresonanztomographie zeigte, dass der Cholinmangel die Fettmasse des gesamten Körpers verringerte, die Magermasse jedoch erhöhte, unabhängig davon, ob sie als absolute Masse oder als relativer Prozentsatz der Gesamtkörpermasse ausgedrückt wurde (Abbildung 1(d)). Cholinmangel erhöhte die Expression der Phosphohormon-sensitiven Lipase im Fettgewebe, einer aktivierten Form des Enzyms (Abbildung 1(e)). Die Morphologie des Fettgewebes änderte sich durch den Cholinmangel hingegen nicht (Abbildung 1(f)).

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Abbildung 1

Cholin-mangelhafte Ernährung vermindert die Körpergewichtszunahme und erhöht die lipolytische Kapazität der Fettgewebe. 8 Wochen alte männliche ob/ob-Mäuse hatten 2 Monate lang freien Zugang zu entweder CD- oder CS-Diäten. Gemessen wurden die Körpergewichtszunahme (a), das Gewebegewicht (b), das Gewicht des epididymalen und perirenalen Fetts (c) sowie die Fettmasse und die Magermasse (d). Die Proteinexpression von phospho- und total-hormonsensitiver Lipase im Fettgewebe wurde durch Immunoblotting bestimmt (e). Die Fettpolsterschnitte wurden mit H & E gefärbt (f). ∗∗𝑃<0,01 und ∗𝑃<0,05 im Vergleich zur CS-Gruppe.

Neben der Beeinflussung des Körpergewichts verringerte der Cholinmangel auch die Nüchternplasmaglukose (14,3±1,67 gegenüber 10,8±1,19, 𝑛=5, 𝑃<0,05) und den Glukagonspiegel (Abbildung 2(a)), obwohl er keinen Einfluss auf den Plasmainsulinspiegel hatte (Abbildung 2(b)). Eine signifikante Verbesserung der Glukose- und Insulinintoleranz wurde bei Mäusen beobachtet, die eine cholinarme Diät erhielten (Abbildungen 2(c)-2(d)). Um den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen, wurden die Schlüsselenzyme für die Glukoseoxidation analysiert. Der Cholinmangel verringerte die hepatische Proteinexpression von PDK4 (Abbildung 3(a)), einem negativen Regulator der Pyruvatdehydrogenase-Aktivität, der den Zufluss von mitochondrialem Acetyl-CoA steuert, was auf eine verbesserte Glukoseverwertung hindeutet. In ähnlicher Weise waren PGC-1α (ein bekannter Upstream-Modulator von PDK4) und PEPCK (ein Downstream-Target von PGC-1 α und ein Schlüsselenzym für die Glukoneogenese) in der Leber reduziert (Abbildung 3(b)), was auf eine verringerte Glukoneogenese schließen lässt. Darüber hinaus untersuchten wir, ob die verbesserte Glukose- und Insulinintoleranz mit der Veränderung der hepatischen Entzündung und der mitochondrialen Funktion zusammenhängen könnte. Weder die Proteinexpression von SOCS3 (Abbildung 3(c)), einem Marker für Proinflammation, noch die Aktivität der mitochondrialen Citrat-Synthase waren betroffen (Daten nicht gezeigt). Allerdings war die Aktivität des mitochondrialen Komplexes II, nicht aber des Komplexes I, durch Cholinmangel signifikant verringert (Abbildung 3(d)). Interessant ist, dass die Proteinexpression des hepatischen Glucagonrezeptors durch Cholinmangel ebenfalls vermindert wurde (Abbildung 3(e)).

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Abbildung 2

Cholin-mangelhafte Ernährung verbessert die Glukose- und Insulinintoleranz. 8 Wochen alte männliche ob/ob-Mäuse hatten 2 Monate lang freien Zugang zu entweder CD- oder CS-Diäten. Der Nüchternplasmaspiegel von Glukagon (a) und Insulin (b) wurde gemessen. Intraperitonealer Glukosetoleranztest (c) und Insulintoleranztest (d) wurden durchgeführt. ∗∗𝑃<0,01 und ∗𝑃<0,05 im Vergleich zur CS-Gruppe.

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Abbildung 3

Molekulare Mechanismen, die an der verbesserten Insulinsensitivität von ob/ob-Mäusen bei Cholin-mangelhafter Ernährung beteiligt sind. 8 Wochen alte männliche ob/ob-Mäuse hatten 2 Monate lang freien Zugang zu entweder CD- oder CS-Diäten. Die hepatische Proteinexpression von PDK4 (a), PEPCK, PGC-1α (b), SOCS3 (c) und Glucagonrezeptor (e) wurde durch Immunoblotting bestimmt. Die Aktivitäten des mitochondrialen Komplexes I und II wurden ebenfalls gemessen (d). ∗𝑃<0,05 im Vergleich zur CS-Gruppe.

Obwohl der Cholinmangel die Glukosetoleranz verbessert, verschlimmert er die Fettleber, was durch die histologische Analyse und die erhöhte hepatische Triglyceridmasse bestätigt wird (Abbildung 4(a)). Um die Mechanismen zu verstehen, die der cholinmangelbedingten Fettleber zugrunde liegen, untersuchten wir die Enzyme, die an der Fettsäure-β-Oxidation und Lipogenese beteiligt sind. Cholinmangel erhöhte die Aktivität der hepatischen Glycerin-3-Phospho-Acyltransferase (GPAT) (Abbildung 4(b)) und verringerte die Aktivität der β-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase (β-HAD) (Abbildung 4(c)), einem Schlüsselenzym der Fettsäure-β-Oxidation, was darauf hindeutet, dass mehr intrazelluläre Fettsäuren in die Lipidbiosynthese statt in die Oxidation geleitet wurden. Dieser Gedanke wurde durch einen Rückgang der hepatischen Phospho-AMPK- und Phospho-ACC-Expression (Abbildung 4(d)) unterstützt, die dann ACC aktiviert und die hepatische Lipogenese fördert.

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4. Diskussion

In früheren Arbeiten haben wir gezeigt, dass eine Cholin-Supplementierung mit einer fettreichen Diät-induzierten Fettleibigkeit und Insulinresistenz bei PEMT-defizienten Mäusen verbunden ist. Kürzlich haben wir festgestellt, dass die cholininduzierte Insulinresistenz cholinspezifisch ist, und zwar nicht nur bei Wildtyp-Mäusen, sondern auch bei PEMT-defizienten Mäusen (Wu und Vance et al. unveröffentlichte Daten). In der aktuellen Studie untersuchten wir die Auswirkungen des Cholinmangels bei ad/ob-Mäusen. Wir konnten fünf neue Auswirkungen des Cholinmangels nachweisen: (1) erhöhte lipolytische Aktivität im Fettgewebe; (2) verbesserte Glukoseoxidation; (3) verringerte hepatische Fettsäureoxidation; (4) herunterregulierte hepatische Glukagonrezeptorexpression; (5) verringerte hepatische mitochondriale Komplex-II-Aktivität.

4.1. Cholinmangel dämpft Körpergewichtszunahme

Cholinmangel dämpft signifikant die fettreiche Diät-induzierte Fettleibigkeit bei Pemt-/- Mäusen und die Gewichtszunahme bei ob/ob-Mäusen. Raubenheimer et al. berichteten jedoch, dass Cholinmangel keine Auswirkungen auf die Gewichtszunahme oder das Gewicht des Fettgewebes hat. Der Unterschied zwischen den beiden Studien könnte auf Unterschiede bei den Tiermodellen und den Fütterungsprotokollen zurückzuführen sein. In Raubenheimers Studie wurden C57Bl/6-Mäuse 8 Wochen lang entweder mit fettreicher oder fettarmer Nahrung gefüttert, aber die Mäuse erhielten nur in den letzten 4 Wochen die CD- oder CS-Diät. Unsere ob/ob-Mäuse wurden 8 Wochen lang mit der fettreichen CD- oder CS-Diät gefüttert. In der Literatur wurden sowohl männliche als auch weibliche ob/ob-Mäuse ausgiebig in Stoffwechselstudien verwendet, z. B. zur Körpergewichtszunahme und zur hepatischen (und muskulären) Insulinempfindlichkeit, und es wurde kein signifikanter geschlechtsspezifischer Effekt festgestellt. In unserer Studie wurden nur männliche ob/ob-Mäuse verwendet.

Unsere aktuelle Studie zeigt, dass Cholin auch die genetisch bedingte Fettleibigkeit modulieren kann. Da der Cholinmangel keinen Einfluss auf die Nahrungsaufnahme hatte, könnte eine erhöhte lipolytische Aktivität der Fettgewebe (verstärkte Expression der aktiven hormonsensitiven Lipase) eine Erklärung für die verringerte Fettmasse und die Zunahme des Körpergewichts sein. Außerdem können wir nicht ausschließen, dass ein Cholinmangel den Energieverbrauch oder die Expression von UCP1 im braunen Fettgewebe und von UCP2/UCP3 in der Skelettmuskulatur erhöhen könnte, was potenzielle Faktoren sind, die zu einer geringeren Körpergewichtszunahme beitragen.

4.2. Cholinmangel verbessert die Glukosetoleranz

Im Gegensatz zur Cholin-Supplementierung, die bei Mäusen zu einer fettreichen Diät und damit zu einer Insulinresistenz führt, verbessert Cholinmangel die Glukosetoleranz bei ad/ob-Mäusen. Dies stimmt mit der Studie von Raubenheimer überein, in der C57Bl/6-Mäuse, die eine fettreiche CD-Diät erhielten, einen niedrigeren Insulinspiegel und eine bessere Glukosetoleranz aufwiesen als Mäuse, die eine fettreiche Diät mit Cholin erhielten. Ein hoher Plasmaglukagonspiegel findet sich in der Regel bei Typ-2-Diabetikern. Die Injektion von Cholin erhöhte bei Ratten sowohl den Plasmainsulin- als auch den Glucagonspiegel. Umgekehrt führte der Cholinmangel in unserer Studie zu einem Rückgang des Plasmaglucagons und einer verminderten Expression des Glucagonrezeptors. Da in den letzten Jahren Glucagonrezeptor-Antagonisten als potenzielle Therapeutika für Typ-2-Diabetes vorgeschlagen wurden, könnte die verringerte Proteinexpression des Glucagonrezeptors bei ob/ob-Mäusen mit Cholinmangel-Diät bis zu einem gewissen Grad die verbesserte Glucosetoleranz erklären. Die verringerte hepatische PGC-1α-Expression ging mit einer Herabregulierung von PEPCK und PDK4 einher, was auf eine verringerte Glukoseproduktion und erhöhte Glukoseoxidation hindeutet. Die Herabregulierung der β-HADH-Aktivität deutete auf eine verminderte Fettsäureoxidation hin. Diese Prozesse wurden von einer verringerten mitochondrialen Komplex-II-Aktivität begleitet, was eine kompensatorische Reaktion auf den verringerten mitochondrialen oxidativen Stress darstellen könnte. Die durch die CD verbesserte Glukosetoleranz war also auf eine verringerte hepatische Glukoseproduktion und eine erhöhte Glukoseverwertung zurückzuführen. Dies könnte durch die Unterdrückung des hepatischen Glucagonrezeptors geschehen, der AMPK über die Adenylatzyklase reguliert und dadurch PGC-1α und seine nachgeschalteten Ziele, wie PEPCK und PDK4, sowie die hepatische mitochondriale Elektronentransportkapazität moduliert. Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um zu beweisen, ob der Glucagonrezeptor ein neues therapeutisches Ziel für Diabetes sein könnte.

4.3. Der Zusammenhang zwischen Fettleber und Insulinresistenz

Die Fettleber ist nachweislich ein von Übergewicht unabhängiger Prädiktor für Typ-2-Diabetes. Es wird angenommen, dass erhöhte intrazelluläre Fettsäuren eine kausale Rolle bei der hepatischen Insulinresistenz spielen. In der aktuellen Studie verschlimmerte Cholinmangel die Fettleber, wobei eine Abnahme der β-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase-Aktivität und eine Zunahme der Glycerinpalmitoyl-Acyltransferase-Aktivität beobachtet wurden, was auf eine Rolle von Cholin bei der Modulation des Fettsäurestoffwechsels hindeutet. Daher könnte die Umleitung von Fettsäuren in die hepatische Triglyceridspeicherung ein erster Schutzmechanismus zur Senkung der hepatischen intrazellulären Fettsäurekonzentrationen sein. Langfristiger Cholinmangel ist jedoch mit Hepatosteatose, dem Risiko von Neuralrohrdefekten sowie dem Risiko von Krebs und Gedächtnisverlust verbunden, was die Verwendung einer cholinarmen Diät als langfristige therapeutische Strategie für Fettleibigkeit und Insulinresistenz einschränken könnte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Cholinmangel eine Körpergewichtszunahme verhindern und die Glukosetoleranz bei ob/ob-Mäusen verbessern kann. Eine bescheidene Einschränkung der Aufnahme von cholinhaltigen Nahrungsmitteln kann Fettleibigen, Prädiabetikern und Diabetikern zugute kommen. Unsere Ergebnisse legen neue mögliche therapeutische Ansätze nahe.

Abkürzungen

Beitrag der Autoren

G. Wu und L. Zhang trugen zu gleichen Teilen bei.

Enthüllung der Autoren

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Dankeschön

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss (MOP 89793) von den Canadian Institutes of Health Research unterstützt.