Laine begann erst mit Mitte zwanzig professionell zu singen. Ihre frühen Einflüsse als Sängerin waren Ella Fitzgerald, Sarah Vaughan, Judy Garland und Lena Horne. Im Alter von 24 Jahren sprach sie erfolgreich für John Dankworths kleine Gruppe, die Dankworth Seven, und später für sein Orchester vor, mit dem sie bis 1958 auftrat. Dankworth und Laine heirateten in diesem Jahr heimlich im Standesamt von Hampstead. Die einzigen Trauzeugen waren der Freund des Paares, der Pianist Ken Moule, und Dankworths Arrangeur David Lindup. Das Paar hatte zwei Kinder, die beide selbst erfolgreiche Musiker sind: Alec, der in den USA lebt, und Jacqui, eine britische Sängerin, die eine Reihe von Alben veröffentlicht hat.
Sie spielte die Hauptrolle in einem neuen Stück am Londoner Royal Court Theatre, der Heimat der neuen Welle von Dramatikern der 1950er Jahre wie John Osborne und Harold Pinter. Dies führte zu weiteren Bühnenauftritten, wie dem Musical Valmouth im Jahr 1959, dem Stück A Time to Laugh (mit Robert Morley und Ruth Gordon) im Jahr 1962, Boots With Strawberry Jam (mit John Neville) im Jahr 1968 und schließlich zu ihrer Rolle als Julie La Verne in Wendy Toyes Inszenierung von Show Boat am Adelphi Theatre in London im Jahr 1971. Show Boat hatte in dieser Londoner Saison mit 910 Aufführungen seine bisher längste Laufzeit.
In dieser Zeit hatte sie zwei große Plattenerfolge. „You’ll Answer to Me“ erreichte die britischen Top 10, während Laine 1961 als „Primadonna“ in der Edinburgh Festival-Produktion von Kurt Weills Oper/Ballett Die sieben Todsünden unter der Regie und Choreographie von Kenneth MacMillan auftrat. 1964 wurde ihr Album Shakespeare and All that Jazz mit Dankworth gut aufgenommen. Dankworth und Laine gründeten 1970 das Stables Theatre in den alten Stallungen auf dem Gelände ihres Hauses. Es war sofort ein Erfolg und gab im ersten Jahr 47 Konzerte.
Laines internationale Aktivitäten begannen 1972 mit einer erfolgreichen ersten Tournee durch Australien, wo sie in den 1970er Jahren sechs Top-100-Alben veröffentlichte. Kurz darauf begann ihre Karriere in den Vereinigten Staaten mit einem Konzert im New Yorker Lincoln Center, 1973 folgte der erste von vielen Auftritten in der Carnegie Hall. Es folgten Tourneen von Küste zu Küste in den USA und Kanada und damit eine Reihe von Schallplattenalben und Fernsehauftritten, darunter 1977 in der Muppet Show. Dies führte nach mehreren Nominierungen zu ihrer ersten Grammy-Auszeichnung für die Live-Aufnahme ihres Carnegie-Konzerts von 1983. Sie ist weiterhin regelmäßig auf Tournee, unter anderem 2005 in Australien.
Sie hat mit James Galway, Nigel Kennedy, Julian Lloyd Webber und John Williams zusammengearbeitet. Weitere wichtige Aufnahmen in dieser Zeit waren Duett-Alben mit Ray Charles (Porgy and Bess) sowie Arnold Schönbergs Pierrot Lunaire, für das sie eine Grammy Award-Nominierung erhielt.
Laines Beziehung zum Musiktheater begann in Großbritannien und setzte sich in den Vereinigten Staaten mit Hauptrollen in Sondheims A Little Night Music und Franz Lehárs The Merry Widow (Michigan Opera) fort. Im Jahr 1980 spielte sie die Hauptrolle in Colette, einem Musical von Dankworth. Das Stück wurde 1979 im Stables Theatre, Wavendon, uraufgeführt und im September 1980 an das Comedy Theatre in London übertragen. 1985 spielte sie die Rolle der Prinzessin Puffer in dem Broadway-Musical The Mystery of Edwin Drood, für das sie eine Tony-Nominierung erhielt. 1989 wurde sie von den Kritikern in Los Angeles für ihre Darstellung der Hexe in Sondheims Into the Woods gelobt.
Im Mai 1992 trat Laine zusammen mit Frank Sinatra für eine Woche in der Royal Albert Hall in London auf.
Ab Ende der 1990er Jahre waren Laines Konzerte weltweit ausverkauft, in der Regel unterstützt von Dankworth mit seiner Band, seinem Orchester oder einer kleineren Gruppe. Zu ihrer üblichen Band gehörten John Horler (Klavier), Alec Dankworth (Bass), Allan Ganley (Schlagzeug) und Mark Nightingale (Posaune).
Laines Autobiographie, Cleo, wurde im September 1994 von Simon & Schuster veröffentlicht. Ihr zweites Buch, You Can Sing If You Want To, wurde im Oktober 1997 von Victor Gollancz veröffentlicht. Im Jahr 2000 trat sie als Sängerin Gwen in dem Film The Last of the Blonde Bombshells auf.
In der Liste der Neujahrsehrungen 1997 wurde Laine zur Dame Commander ernannt, und sie wurde zur Dame Cleo Laine DBE. In der Liste der Neujahrsehrungen 2006 wurde ihr Mann als Sir John Dankworth in den Ritterstand erhoben. Sie waren eines der wenigen Paare, bei denen beide Partner ihre Titel eigenständig innehatten, und das einzige Paar im Jazz, das auf diese Weise ausgezeichnet wurde.
Dankworth starb am 6. Februar 2010, wenige Stunden vor einem geplanten Konzert im Stables-Theater in Wavendon zur Feier des 40-jährigen Bestehens des Theaters. Er war nach einer Konzerttournee in den Vereinigten Staaten mehrere Monate lang krank gewesen. Trotz ihrer Trauer trat Laine zusammen mit der John Dankworth Big Band und mehreren Familienmitgliedern bei dem Konzert zum 40-jährigen Bestehen des Theaters auf und gab seinen Tod erst am Ende bekannt. Laines Entscheidung, aufzutreten, war weltweit auf den Titelseiten der Zeitungen zu lesen, einschließlich eines Fotos von ihr auf der Titelseite der Times.
Eine Woche nach Dankworths Tod sprang Laine für ihren verstorbenen Ehemann ein und gab erneut ein Konzert in Pinner im Nordwesten Londons. In den Monaten nach Dankworths Tod trat Laine weiterhin auf und gab Interviews. Im Juni und Juli 2010 trat sie als Hauptact beim Festival Music in the Garden in Wavendon auf.
Im März 2010 wurde die letzte musikalische Zusammenarbeit von Laine und Dankworth auf CD und als Download veröffentlicht – Jazz Matters. Auf der Aufnahme spielte die Dankworth Big Band neue Kompositionen, die Dankworth für den Auftritt des Paares bei den Proms 2007 in der Royal Albert Hall geschrieben hatte.
Laine ist nicht nur für ihren Interpretationsstil, sondern auch für ihren fast vier Oktaven umfassenden Stimmumfang und ihre stimmliche Anpassungsfähigkeit berühmt. Laine trifft nicht nur tiefe, gefühlvolle Töne, sondern auch Scattern und Spitzentöne sind zu ihrem Markenzeichen geworden. Obwohl ihr natürlicher Tonumfang der einer Altstimme ist, kann sie ein G über dem hohen C erzeugen. Derek Jewel von der Sunday Times bezeichnete sie als „ganz einfach die beste Sängerin der Welt“
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