Clinical Immunogenetics Laboratory

Eine Chimäre war in der griechischen Mythologie eine Kreatur, die gewöhnlich als eine Mischung aus Löwe, Ziege und Schlange dargestellt wurde. Die heutige Verwendung des Begriffs „Chimärismus“ in der hämatopoetischen Zelltransplantation leitet sich von dieser Idee einer „gemischten“ Entität ab und bezieht sich auf jemanden, der ein Transplantat aus genetisch unterschiedlichem Gewebe erhalten hat. Ein Test auf Chimärismus nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation beinhaltet die Identifizierung der genetischen Profile des Empfängers und des Spenders und die anschließende Bewertung des Ausmaßes der Vermischung im Blut, Knochenmark oder anderen Geweben des Empfängers.

Chimärismus-Tests (Engraftment-Analysen) mittels DNA verwenden Methoden, die üblicherweise bei menschlichen Identitätstests eingesetzt werden, und werden durch die Analyse genomischer Polymorphismen, so genannter Short Tandem Repeat (STR) Loci, durchgeführt. Diese Loci bestehen aus einer Kern-DNA-Sequenz, die innerhalb eines bestimmten genetischen Locus unterschiedlich oft wiederholt wird. Der Begriff STR, der auch als Mikrosatelliten bezeichnet wird, bezieht sich auf die Anzahl der Basenpaare einer tandemartig wiederholten Kern-DNA-Sequenz, deren Länge zwischen 2 und 8 Basenpaaren liegt. Diese Loci weisen Allele auf, die sich in ihrer Länge von Individuum zu Individuum unterscheiden können und als kodominante Mendelsche Merkmale vererbt werden. STR-Loci wurden im gesamten menschlichen Genom identifiziert, und einige Loci weisen mehr als 25 Allele auf.

Die DNA-Sequenzinformationen in den konservierten flankierenden Regionen der Loci werden zur Erstellung von Oligonukleotid-Primerpaaren für die STRs verwendet. Diese Primer werden bei der PCR-Amplifikation (Polymerase-Kettenreaktion) von Testproben verwendet. Mit dieser Technik kann die STR-Sequenz bis zu einer Milliarde Mal amplifiziert werden, wodurch Material entsteht, das mit einem elektrophoretischen Gel oder durch Kapillarelektrophorese (CE) aufgetrennt werden kann. Die Genotypisierung erfolgt durch Auswertung der DNA-Fragmentgrößen. Zur genauen Identifizierung der STR-Allele kann eine Allelleiter herangezogen werden.

Das PCR-basierte STR/CE-System hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Analysemethoden. Die Amplifikation mehrerer STR-Loci kann in einem einzigen Röhrchen kombiniert (multiplexed) werden, was die Analyse von bis zu sechzehn Loci in einer Reaktion ermöglicht. Da nur geringe DNA-Mengen benötigt werden, können auch Proben mit geringer Zellzahl verwendet werden, und die geringe Größe der STR-Allele ermöglicht sogar die Verwendung degradierter DNA-Proben. Die digitalen Daten erleichtern die Analyse und Archivierung, und das CE-Verfahren ist sowohl schnell als auch kostengünstig. Die PCR-Amplifikation und Analyse von STR-Loci stellt eine schnelle und zuverlässige Methode zur Bewertung des Transplantationsstatus bei Stammzelltransplantationen dar.

Die derzeit verwendete Technologie ermöglicht die Co-Amplifikation und den dreifarbigen Nachweis von sechzehn Loci, die in drei Gruppen von 5 oder 6 Loci unterteilt sind, die amplifizierte Fragmente mit nicht überlappenden Größenbereichen aufweisen.

Während des PCR-Amplifikationsschritts werden die amplifizierten Fragmente mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Nach der PCR-Amplifikation werden die Proben auf einem Kapillarelektrophoresesystem (CE) verarbeitet.

Die Datenanalyse wird durch eine Fragmentanalysesoftware erleichtert, die die Größe der DNA-Fragmente anhand eines mit der Probe gelaufenen internen Lane-Standards bestimmt und die Genotypen durch Vergleich mit einer im CE-Lauf enthaltenen STR-Allel-Leiter zuordnet. Dies liefert eindeutige genotypische STR-Profile für den Spender und für den Transplantatempfänger. STR-Loci, die zwischen diesen Individuen polymorph (d. h. informativ) sind, werden verwendet, um die relativen Mengen an Empfänger- und Spender-DNA in der Posttransplantationsprobe zu bewerten.

Die getesteten Proben können aus jedem DNA-haltigen Material stammen, einschließlich Knochenmark, peripherem Blut, soliden Tumoren, epidermalem Gewebe, Haarfollikeln, Wangenabstrichen und fraktionierten Zelluntergruppen. Da die PCR-Amplifikation einer Probe routinemäßig mit weniger als 2 ng genomischer DNA (entspricht etwa 300 Zellen) durchgeführt wird, kann der Chimärismus-Test mit dieser Methode auch bei Patienten mit Transplantatversagen, schwerer Leukopenie oder aus Fraktionen hämatopoetischer Zelluntergruppen erfolgreich durchgeführt werden. Die STR-Analyse wurde eingesetzt, um den Transplantationsstatus von Patienten zu bewerten, die eine hämatopoetische Zelltransplantation erhalten haben, einschließlich Patienten, die doppelte Nabelschnurblutspendereinheiten oder eine zweite Transplantation von einem anderen Spender erhalten haben, sowie zur Bestätigung der genetischen Identität von mutmaßlichen eineiigen Zwillingen und zum Nachweis der in-utero abgeleiteten mütterlichen Zelltransplantation bei Patienten mit der Diagnose eines schweren kombinierten Immundefekts (SCID). Die STR/CE-Analyse ist ein schnelles, zuverlässiges, genaues und reproduzierbares Verfahren.

Grenzwerte des Assays

1. Aus den Testproben muss ausreichend DNA isoliert werden, um eine robuste PCR-Amplifikation zu ermöglichen. Es müssen Methoden zur DNA-Isolierung zur Verfügung stehen, um Proben mit geringer Zellzahl zu verarbeiten, wie sie bei Empfängern mit Transplantatversagen und aus durchflusszytometrisch sortierten Untergruppen von weißen Blutkörperchen mit spezifischer Abstammung auftreten können. Die Proben können Konzentrationen aufweisen, die für eine Quantifizierung mittels UV-Spektrophotometrie OD260 zu niedrig sind. DNA-Proben von 5.000 bis 30.000 isolierten Zellen liefern zuverlässig eine akzeptable Amplifikation. Das Labor verfügt über Richtlinien, in denen festgelegt ist, wann die Probenanalyse wiederholt werden sollte.
2. Mit den kommerziellen Kits haben viele STR-Loci informative Allele sowohl für den Spender als auch für den Empfänger, wenn es sich um einen nicht verwandten Spender handelt. Die Anzahl der informativen STR-Loci kann jedoch bei Transplantationspaaren mit verwandten Spendern auf bis zu 3 begrenzt sein. Quantitative Werte, die den Mittelwert von nur 3 STR-Loci darstellen, haben sich als reproduzierbar erwiesen.
3. Patienten mit bösartigen Erkrankungen können klonale Mutationen aufweisen, die bestimmte STR-Loci beeinflussen. Beim Vergleich der Allele, die in der Probe des Patienten vor der Transplantation und in der Probe nach der Transplantation identifiziert wurden, kann ein Patienten-Allel an einem oder mehreren STR-Loci nicht vorhanden sein. In seltenen Fällen kann ein zusätzliches STR-Allel des Patienten an einem bestimmten Locus entdeckt werden, das in der Probe vor der Transplantation nicht vorhanden war. In den meisten Fällen sind diese Anomalien wahrscheinlich auf Chromosomentranslokationen zurückzuführen. Fehlende Allele könnten auch das Ergebnis einer Mutation innerhalb der konservierten flankierenden STR-Sequenzen sein, in denen sich die PCR-Primer befinden. Die Daten von STR-Loci mit fehlenden oder zusätzlichen Allelen werden nicht für die Quantifizierung verwendet.
4. Wenn die Zellen des Patienten vor der Transplantation nicht verfügbar sind, können Proben wie Wangenabstriche, Hautbiopsien oder Haarwurzeln nach der Transplantation entnommen werden. Es ist jedoch zu beachten, dass Wangenproben erhebliche Mengen an Spenderzellen enthalten können.
5. Der Test ist nicht für den Nachweis einer minimalen Resterkrankung vorgesehen.

Klinische Indikationen für Chimärismus-Tests bei hämatopoetischen Zelltransplantationen

Routinemäßige Dokumentation der Herkunft der weißen Blutzellen im peripheren Blut und/oder Knochenmark nach der Transplantation, die vom Spender/Empfänger stammen. Die Dokumentation der Transplantation kann die Untersuchung von linienspezifischen Zelluntergruppen umfassen, z. B. CD3-positive T-Zellen und CD33-positive myeloische Zellen.

Bewertung der Spender-/Empfängerzellen bei Patienten mit unzureichender Knochenmarkfunktion.

Bestimmen, ob rezidivierende oder neue Malignität von Empfänger- oder Spenderzellen ausgeht.

Prognoserisiken für Abstoßung und rezidivierende Malignität bewerten.

Dokumentieren, ob Spenderzellen nach der Transplantation bei Patienten mit rezidivierender Erkrankung oder vor einer Spenderlymphozyteninfusion (DLI) persistieren.

Bewerten Sie, ob bei Empfängern, die Kandidaten für eine zweite Transplantation sind, eine Transplantatabstoßung aufgetreten ist.

Unterscheiden Sie die Herkunft der Spenderzellen bei Empfängern, die eine zweite Transplantation mit einem anderen Spender oder eine Transplantation mit doppelten Nabelschnurbluteinheiten erhalten haben.

Nachweis von mütterlichen Zellen bei Patienten mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID).

Überprüfung der genetischen Identität von mutmaßlichen eineiigen Zwillingen.

Häufig gestellte Fragen

Frage: Wie werden Mehrfachspender analysiert?
Antwort: Es ist wichtig, STR-Loci zu identifizieren, die mindestens ein eindeutiges STR-Allel für den Patienten und jeden Spender aufweisen.

Frage: Warum wird das mütterliche Engraftment getestet?
Antwort: Bei Patienten, bei denen ein schwerer kombinierter Immundefekt (SCID) diagnostiziert wurde, kann es vorkommen, dass sie in der Gebärmutter mit hämatopoetischen Zellen mütterlichen Ursprungs transplantiert wurden. Bestimmte linienspezifische Zelluntergruppen (insbesondere CD3-positive Zellen) können überwiegend oder vollständig mütterlichen Ursprungs sein.

Frage: Was ist der Unterschied zwischen „vollem“ und „gemischtem“ Chimärismus?
Antwort: „Vollständiger“ Chimärismus bezieht sich auf einen Patienten, der nach der Transplantation einen Phänotyp in den hämatopoetischen Zellen aufweist, der ausschließlich vom Spender stammt.
„Gemischter“ Chimärismus bezieht sich auf einen Patienten, der nach der Transplantation eine Mischung aus Patienten- und Spenderphänotyp in den hämatopoetischen Zellen aufweist.

Frage: Was ist, wenn keine Baseline-Probe des Empfängers verfügbar ist?
Antwort: Für die Gewinnung einer Empfängerprobe nach der Transplantation stehen mehrere Möglichkeiten zur Verfügung: Wangenschleimhaut-, Haarwurzel- oder Hautbiopsieproben können für eine Empfänger-Basistestprobe verwendet werden. Wangenschleimhautproben sollten mit Vorsicht verwendet werden, da Spenderzellen in erheblichen Mengen in Wangenschleimhautproben vorhanden sein können.

Frage: Was ist, wenn keine Ausgangsprobe des Spenders verfügbar ist?
Antwort: Wenn der Spender noch lebt, muss eine neue Blutprobe entnommen werden. Wenn der Spender nicht mehr lebt, sollten die Proben nach der Transplantation mit der Ausgangsprobe des Patienten vor der Transplantation verglichen werden, um STR-Allele zu identifizieren, die zwar nachgewiesen werden, aber nicht vom Patienten stammen.

Frage: Warum ist HLA kein geeignetes Mittel zur Überwachung der Transplantation?
Antwort: Transplantationsspender werden so ausgewählt, dass sie möglichst genau mit dem Empfänger übereinstimmen. Es gibt keine HLA-Marker, die Empfänger und Spender unterscheiden, wenn sie übereinstimmen, und nur einen oder zwei, wenn sie nicht übereinstimmen. Außerdem sind andere Technologien für diesen Zweck oft empfindlicher als die Überwachung von nicht übereinstimmenden HLA-Allelen; daher werden andere Loci verwendet, um einzigartige Profile zu erstellen.

Frage: Was ist ein informativer STR-Locus?
Antwort: Dies ist ein Locus mit mindestens einem Allel, das für den Empfänger oder den Spender einzigartig ist. Um für Chimärismusberechnungen nützlich zu sein, muss ein Locus Allele haben, die für beide einzigartig sind. Es kann eine große Anzahl informativer Loci geben, wenn ein nicht verwandter Spender für die Transplantation verwendet wird, aber nur sehr wenige, wenn ein passendes Geschwisterteil verwendet wird. Aufgrund der unterschiedlichen Amplifikationseffizienz der Allele an den einzelnen Loci ist es vorzuziehen, Mittel- oder Medianwerte von mehreren Loci zu erhalten, um die Genauigkeit zu erhöhen. Die Ergebnisse der einzelnen Loci sind zuverlässig reproduzierbar, so dass auch nur ein Locus für die Trendbestimmung aufeinander folgender Proben verwendet werden kann.

Frage: Was ist der „Amelogenin“-Locus, der in einigen Amplifikationspanels enthalten ist?
Antwort: Das Amelogenin-Gen befindet sich auf den X- und Y-Chromosomen. Es handelt sich nicht um eine STR, sondern weist unterschiedliche Größen von Produkten auf den jeweiligen Chromosomen auf. Dadurch ist es für die Bestimmung des Geschlechts nützlich. Es ist im Primer-Panel kommerzieller Kit-Anbieter enthalten, die auf die forensische Gemeinschaft abzielen, in der die X/Y-Differenzierung weit verbreitet ist. Er wird im Allgemeinen nicht für die Chimärismus-Analyse verwendet, da er keinen eindeutigen weiblichen Marker liefern kann (eine männliche Probe enthält immer ein X-Allel); er ist auch nicht hilfreich bei der Auswertung von Proben nach einer geschlechtsangleichenden Stammzelltransplantation.

Frage: Wie unterscheidet sich die STR-Chimärismusanalyse von der Genotypisierung?
Antwort: Der Begriff „Genotyp“ bezieht sich auf die bestimmten Allele, die an einem bestimmten Locus vorhanden sind. Die Genotypisierung wird durchgeführt, um bei Chimärismus-Tests Empfänger- und Spenderprofile zu erstellen. Wenn nach einer Stammzelltransplantation eine Chimärismusanalyse durchgeführt wird, werden die genotypischen Profile des Empfängers und des Spenders mit dem Profil der Proben nach der Transplantation verglichen, um zu ermitteln, wie viel von jeder Komponente vorhanden ist.

Genotypisierung wird auch in anderen Szenarien wie Forensik und Abstammungstests verwendet. Forensische Analysten verwenden Genotypen, um die Quelle von Beweisen in Kriminalfällen zu identifizieren und um Personen als Verdächtige auszuschließen. Sie können auch menschliche Überreste in „John Doe“-Fällen und bei Massenkatastrophen identifizieren. Abstammungsuntersuchungen werden in ähnlicher Weise durchgeführt, um jemanden als möglichen Elternteil auszuschließen, indem Allele im Kind gefunden werden, die weder mit der Mutter noch mit dem mutmaßlichen Vater übereinstimmen.

Zitierte Literatur/empfohlene Lektüre

Bryant E, Martin PJ. Dokumentation des Engraftments und Charakterisierung des Chimärismus nach hämatopoetischer Zelltransplantation. In: Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. Hämatopoetische Zelltransplantation. 2nd ed. Malden, MA: Blackwell Science, 1998.

Bultler J. Forensic DNA Typing. Elsevier Academic Press.