Besucher aus den USA und Kanada können HIER ein KOSTENLOSES PROBENMUSTER unseres CTAB-basierten SYNERGY™ 2.0 Pflanzen-DNA-Extraktionskits anfordern.
Die Isolierung von DNA aus Pflanzengeweben kann eine große Herausforderung darstellen, da die Biochemie zwischen verschiedenen Pflanzenarten extrem unterschiedlich sein kann. Im Gegensatz zu tierischen Geweben, bei denen derselbe Gewebetyp von verschiedenen Arten in der Regel ähnliche Merkmale aufweist, können Pflanzen unterschiedliche Mengen an Metaboliten und strukturellen Biomolekülen enthalten. Polysaccharide und Polyphenole sind zwei Klassen pflanzlicher Biomoleküle, die zwischen den Arten stark variieren und bei der Isolierung von DNA sehr problematisch sind. Verunreinigende Polysaccharide und Polyphenole können die Manipulation der DNA nach der Isolierung beeinträchtigen.
Es gibt Methoden, die Polysaccharide und Polyphenole wirksam aus pflanzlichen DNA-Präparaten entfernen. Die Verwendung von CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid), einem kationischen Detergens, erleichtert die Abtrennung von Polysacchariden während der Reinigung, während Zusätze wie Polyvinylpyrrolidon bei der Entfernung von Polyphenolen helfen können. Extraktionspuffer auf CTAB-Basis sind bei der Reinigung von DNA aus Pflanzengewebe weit verbreitet.
Eine Möglichkeit der DNA-Reinigung mit CTAB macht sich zunutze, dass Polysaccharide und DNA je nach Natriumchloridkonzentration unterschiedliche Löslichkeiten in CTAB haben. Bei höheren Salzkonzentrationen sind die Polysaccharide unlöslich, während die DNA bei niedrigeren Konzentrationen unlöslich ist. Folglich können durch Anpassung der Salzkonzentration in CTAB-haltigen Lysaten Polysaccharide und DNA unterschiedlich ausgefällt werden.
Polyphenole sind Verbindungen, die mehr als einen Phenolring enthalten (z. B. Tannin), eine Struktur, die sehr effizient an DNA bindet. Sie kommen natürlich in Pflanzen vor, werden aber auch bei Gewebeschäden (Verbräunung) gebildet. Bei der Homogenisierung von Pflanzengeweben werden Polyphenole durch freigesetzte Polyphenoloxidase synthetisiert. Die Zugabe von Polyvinylpyrrolidon verhindert die Wechselwirkung zwischen DNA und phenolischen Ringen, indem es die Polyphenole bindet.
CTAB-basierte Protokolle funktionieren in der Regel sehr gut, aber ein wesentlicher Nachteil ist, dass Chloroformextraktionen routinemäßig verwendet werden, um organische lösliche Moleküle von der DNA zu trennen. Da Chloroform krebserregend ist, lehnen viele Institutionen seine Verwendung ab. Daher wurde von OPS Diagnostics eine alternative Methode entwickelt, die Chloroform vermeidet; sie ist auf der Seite Synergy™ Plant DNA Extraction Kit zu finden.
Materialien
- CTAB-Puffer: 2% Cetyltrimethylammoniumbromid, 1% Polyvinylpyrrolidon, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, oder CTAB-Extraktionspuffer
- Zentrifuge (bis zu 14.000 x g)
- RNase A Lösung
- Isopropanol
- 70% Ethanol
- 2 ml Zentrifugenröhrchen
- SpeedVac
- TE Puffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)
Methode
Pflanzenproben können durch kryogenes Zermahlen von Gewebe in einem Mörser und Stößel nach dem Abkühlen in flüssigem Stickstoff vorbereitet werden. Gefriergetrocknete Pflanzen können bei Raumtemperatur gemahlen werden. In beiden Fällen ist ein feines Pulver für die DNA-Extraktion am besten geeignet.
- Für jeweils 100 mg homogenisiertes Gewebe 500 µl CTAB-Extraktionspuffer verwenden. Mischen und gründlich vortexen. Überführen Sie das Homogenisat für 30 Minuten in ein 60°C-Bad.
- Nach der Inkubationszeit das Homogenat 5 Minuten lang bei 14.000 x g zentrifugieren.
- Den Überstand in ein neues Röhrchen überführen. 5 µl RNase-Lösung A zugeben und 20 Minuten bei 37 °C inkubieren
- Ein gleiches Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugeben. 5 Sekunden lang vortexen, dann die Probe 1 Minute lang bei 14.000 x g zentrifugieren, um die Phasen zu trennen. Überführen Sie die wässrige obere Phase in ein neues Röhrchen. Wiederholen Sie diese Extraktion, bis die obere Phase klar ist.
- Transferieren Sie die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen. Präzipitieren Sie die DNA durch Zugabe von 0,7 Volumina kaltem Isopropanol und inkubieren Sie sie bei -20°C für 15 Minuten.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 x g für 10 Minuten. Dekantieren Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und waschen Sie anschließend mit 500 µl eiskaltem 70%igem Ethanol. Dekantieren Sie das Ethanol. Entfernen Sie das restliche Ethanol durch Trocknen in einem SpeedVac.
- Trocknen Sie das Pellet lange genug, um den Alkohol zu entfernen, ohne jedoch die DNA vollständig zu trocknen. Lösen Sie die DNA in 20 µl TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Das Pellet muss eventuell erwärmt werden, um sich aufzulösen.
Optionales Protokoll:
Die Verwendung von Silica-Spin-Säulen kann eine höhere Qualität der DNA ergeben. Für ein optionales Protokoll, klicken Sie hier.