DNA-Methyltransferasen (MTasen), die eine Methylgruppe von S-Adenosylmethionin auf Adenin- oder Cytosinreste übertragen, sind in einer Vielzahl von Prokaryoten und Eukaryoten zu finden. Die Methylierung sollte beim DNA-Verdau mit Restriktionsendonukleasen berücksichtigt werden, da die Spaltung blockiert oder beeinträchtigt werden kann, wenn eine bestimmte Base in der Erkennungsstelle methyliert ist.
Prokaryotische Methylierung
In Prokaryonten wurden MTasen am häufigsten als Elemente von Restriktions-/Modifikationssystemen identifiziert, die die Wirts-DNA vor der Spaltung durch die entsprechende Restriktionsendonuklease schützen sollen. Die meisten Laborstämme von E. coli enthalten drei ortsspezifische DNA-Methylasen.
- Dam-Methylase-Methylierung an der N6-Position des Adenins in der Sequenz GATC (1,2).
- Dcm-Methyltransferasen-Methylierung an der C5-Position des zweiten Cytosins in den Sequenzen CCAGG und CCTGG (1,3).
- EcoKI-Methylase-Methylierung von Adenin in den Sequenzen AAC(N6)GTGC und GCAC(N6)GTT.
Einige oder alle Stellen für eine Restriktionsendonuklease können gegen die Spaltung resistent sein, wenn sie aus Stämmen isoliert werden, die die Dam- oder Dcm-Methylasen exprimieren, wenn die Methylase-Erkennungsstelle die Endonuklease-Erkennungsstelle überlappt. So ist zum Beispiel Plasmid-DNA, die aus Dam+ E. coli isoliert wurde, vollständig resistent gegen die Spaltung durch MboI, das an GATC-Stellen spaltet.
Nicht alle aus E. coli isolierte DNA ist in gleichem Maße methyliert. Während die pBR322-DNA vollständig modifiziert ist (und daher völlig resistent gegen den MboI-Verdau ist), sind nur etwa 50 % der λ-DNA-Stellen methyliert, vermutlich weil die Methylase keine Gelegenheit hat, die DNA vollständig zu methylieren, bevor sie in den Phagenkopf verpackt wird. Infolgedessen ergeben Enzyme, die durch Dam- oder Dcm-Modifikation blockiert sind, partielle Verdauungsmuster mit λ-DNA.
Restriktionsstellen, die durch Dam- oder Dcm-Methylierung blockiert sind, können durch Klonierung Ihrer DNA in einen Dam-, dcm-Stamm von E. coli, wie z. B. dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925), unmethyliert werden.
Restriktionsstellen können auch blockiert werden, wenn eine überlappende Stelle vorhanden ist. In diesem Fall wird ein Teil der Dam- oder Dcm-Sequenz durch die Sequenz des Restriktionsenzyms erzeugt, gefolgt von der flankierenden Sequenz. Diese Situation sollte auch beim Entwurf von Restriktionsenzymverdauungen berücksichtigt werden.
Eukaryotische Methylierung
CpG-MTasen, die in höheren Eukaryoten vorkommen (z. B. Dnmt1), übertragen eine Methylgruppe an die C5-Position von Cytosinresten. Die Muster der CpG-Methylierung sind vererbbar, gewebespezifisch und korrelieren mit der Genexpression. Folglich wird der CpG-Methylierung eine Rolle bei der Differenzierung und Genexpression zugeschrieben (4).
Hinweis: Die Auswirkungen der CpG-Methylierung sind vor allem beim Verdau eukaryotischer genomischer DNA von Bedeutung. CpG-Methylierungsmuster werden nicht beibehalten, wenn die DNA in einen bakteriellen Wirt kloniert wird.
Methylierungssensitivität
Die nachstehende Tabelle fasst die Methylierungssensitivität für NEB-Restriktionsenzyme zusammen und gibt an, ob die Spaltung durch Dam-, Dcm- oder CpG-Methylierung blockiert oder beeinträchtigt wird, wenn sie die jeweilige Erkennungsstelle überlappt. Diese Tabelle sollte als Leitfaden für das Verhalten der aufgeführten Enzyme und nicht als absoluter Indikator betrachtet werden. Ausführlichere Informationen und spezifische Beispiele, auf denen diese Leitlinien beruhen, finden Sie in der Restriktionsenzyme-Datenbank REBASE.
- Marinus, M.G. und Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143-1150. PMID: 4576399
- Geier, G.E.and Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408-1413. PMID: 368070
- May, M.S. und Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768-770. PMID: 1097428
- Siegfried, Z. und Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID: 9115385
Legend
| ● | Nicht empfindlich | ◆ | Beeinträchtigt |
| ◼ | Blockiert | ◇ ol | Behindert durch Überlappung |
| ◻ ol | Blockiert durch Überschneidungen | ◇ scol | Behindert durch einige Kombinationen von Überschneidungen |
| ◻ scol | Blockiert durch einige Kombinationen von Überschneidungen | ||
Einzelbuchstabencode